Mir-125b和PIGF在早期流产孕妇绒毛组织及血清中的表达及意义

杨艳华， 吴 军， 严 格

(湖北省天门市第一人民医院妇产科， 湖北 天门 431700)

流产分为自然流产和人工流产，其中自然流产发生率占全部妊娠的15%左右，多发生在12周前，病因复杂，包括遗传、免疫、感染、甚至器官异常、配偶等因素等[1]。然而仍有部分自然流产发生原因不明，子宫胎盘循环异常可能起重要作用，但尚不完全明确。血管内皮生长因子(VEGF)在绒毛膜中表达水平降低与稽留流产有关。胎盘生长因子(placental growth factor，PIGF)是VEGF家族中的一员，能够促进早孕时滋养层细胞增殖分化及迁移过程，对绒毛膜、肿瘤血管形成发挥重要作用[2]。检测血清PIGF对胎盘功能评价及子痫前期预测有重要价值。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性调控基因转录后表达的非编码RNA，可通过抑制其下游靶基因参与机体多种疾病发生。胎盘滋养层细胞中微小RNA-125b(mir-125b)可靶向维生素D受体，参与胎盘形成及其生长发育及滋养层细胞凋亡[3]。但关于mir-125b与PIGF在自然流产中的表达及关系尚鲜有报道，因此本研究拟检测自然流产患者中mir-125b和PIGF表达，以探究其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料:选择2017年7月至2019年10月本院收治的孕早期自然流产妇女105例为研究对象，年龄18-35岁，平均年龄(29.13±5.54)岁，平均体质指数(body mass index，BMI)为(22.91±2.46)Kg/m2，孕周4-12周，平均孕周(7.97±1.57)周，有吸烟史者12例，饮酒史者41例。另选择105例人工流产孕妇为对照组，年龄18-35岁，平均年龄(28.13±5.27)岁，BMI(22.67±2.25)kg/m2，孕周4-12周，平均孕周(7.65±1.54)周，有吸烟史者8例，饮酒史者32例。两组受试者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经天门市第一人民医院伦理委员会审批通过，另获得受试者同意并签字确认。自然流产女性纳入标准：①妊娠12周内自然流产流产孕妇；②彩超提示宫内妊娠，但无胚芽和心管搏动；③白带检查、超声检查无异常；④男方精液检查正常，夫妻双方无染色体异常。对照组纳入标准：①妊娠12周内要求人工流产正产妊娠者；②无阴道流血等先兆流产症状；③彩超检查胚胎正常，有胚芽和心管搏动。排除标准：①生殖道畸形或发生感染者；②有既往不良妊娠史或流产史者；③合并高血压、心脏病、甲状腺疾病、肾病等疾病患者；④不自愿参加本次调查研究者；⑤就诊前3个月使用甾体类激素者；⑥子宫内膜炎或其他可引起流产的慢性传染病等。

1.2主要试剂及仪器:microRNA定量(qRT-PCR)试剂盒(批号：638315)、TB Green®Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)试剂盒(批号：RR820A)均购自宝生物工程(大连)有限公司；PIGF ELISA试剂盒(批号：EHPGF)、鼠源PIGF抗体(批号：MA1-188)、GAPDH抗体(批号：AM4300)、二抗羊抗鼠IgG(批号：B-2752)均购自美国Invitrogen公司。紫外分光光度计、MODEL550型酶标仪购自美国Thermo公司；7500型RT-qPCR仪购自美国Bio-Rad公司等。

1.3方 法

1.3.1样本采集:所有女性流产组织取出后，无菌条件下用PBS冲洗，滤纸吸干，将周围结缔组织去除后，分离绒毛膜组织，分装于2.0mL冻存管，置于液氮中保存待检。采集所有受试者空腹外周静脉血，常规分离血清，置于-80℃冰箱待检。

1.3.2绒毛膜组织中mir-125b、PIGF mRNA水平检测:绒毛膜组织样品总RNA采用Trizol提取，并应用紫外分光光度计对总RNA浓度及纯度进行检测。反转录得到cDNA，保存于-20℃，备用。mir-125b、PIGF mRNA表达水平采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测。20μL反应体系：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μL，ROX Reference Dye or Dye II(50×)0.4μL ，cDNA(50 ng/μL)2μL，上下游引物(10 μM)各0.8μL，dd H2O 6.0μL。反应条件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s，共40个循环；添加溶解曲线。mir-125b、PIGF mRNA及内参U6、GAPDH的引物序列见表1。引物由上海吉玛生物科技有限公司合成。采用2-△△CT法对绒毛膜组织中mir-125b、PIGF mRNA的相对表达水平进行定量分析。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.3绒毛膜组织中PIGF蛋白水平检测:应用蛋白抽提试剂盒将绒毛膜组织总蛋白提取，蛋白浓度采用BCA试剂盒检测，并保存于-80℃冰箱，备用。60g蛋白样品在6%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳2h(电压80mV)，PVDF膜转膜70min(恒流250 mA)。然后在室温条件下，5%脱脂奶粉封闭2 h，并加入适量PBS稀释(含2%脱脂奶粉)，后加一抗(PIGF抗体1:500；GAPDH抗体1:500)，在4 ℃下孵育过夜，并应用TBST缓冲液洗膜3次，20 min/次，用适量PBS稀释(含2%脱脂奶粉)的辣根过氧化物酶标记二抗IgG(1:5000)在室温条件下孵育1.5h，依次洗膜，显色，曝片，观察结果并进行分析。

1.3.4血清mir-125b、PIGF水平检测:血清mir-125b方法采用RT-qPCR，同1.4.2。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清PIGF水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1自然流产组及对照组女性一般资料比较:对比年龄、BMI、孕周、吸烟史、饮酒史比例，对照组、自然流产组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 自然流产组及对照组女性一般资料比较

2.2自然流产组及对照组女性绒毛膜组织及血清mir-125b、PIGF表达水平比较:与对照组比较，自然流产组女性绒毛膜组织mir-125b水平显著升高、PIGF mRNA水平显著降低，血清mir-125b水平显著升高、PIGF水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 自然流产组及对照组女性绒毛膜组织中mir-125b PIGF表达水平比较

2.3自然流产组及对照组女性绒毛膜组织中PIGF蛋白表达水平比较:与对照组比较，自然流产组女性绒毛膜组织中PIGF蛋白水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4、图1。

表4 自然流产组及对照组女性绒毛膜组织中PIGF蛋白表达水平比较

图1 WB检测绒毛膜组织中PIGF蛋白表达

2.4自然流产女性绒毛膜组织、血清mir-125b、PIGF表达水平相关性分析:Pearson法分析结果显示，自然流产女性绒毛膜组织、血清mir-125b水平与PIGF蛋白水平均呈负相关性(r=-0.643、-0.691，P<0.05)。详见图2。

2.5血清mir-125b、PIGF水平对孕早期自然流产患者的预测价值:分别以血清mir-125b、PIGF水平及二者联合预测值为检验变量绘制ROC曲线，结果显示，血清mir-125b、PIGF水平预测孕早期自然流产发生的曲下面积(area under the curve，AUC)分别为0.896(95%CI：0.850-0.943)、0.884(95%CI：0.838-0.929)，mir-125b≥1.630预测自然流产发生的灵敏度为95.30%，特异度为84.60%，PIGF≤42.553 pg/mL预测自然流产发生的灵敏度为90.60%，特异度为77.90%；二者联合检测预测孕早期自然流产发生的AUC为0.954，灵敏度为89.60%，特异度为92.30%。详见图3，表5。

图2 自然流产女性绒毛膜组织、血清中mir-125b、PIGF表达水平相关性分析

图3 血清mir-125b、PIGF水平对孕早期自然流产发生的预测价值ROC曲线

表5 血清mir-125b PIGF水平对孕早期自然流产发生的预测价值

3 讨 论

妊娠是一个极为复杂的过程，妊娠后滋养层细胞血管形成可为胚胎提供氧气及营养物质，保证胚胎正常发育。如果着床后绒毛血管发育异常或生成不足，则将发生流产。VEGF是一种特殊的内皮细胞有丝分裂原，可促进内皮细胞生长、分化，促进血管生成，在正常人中表达水平低，在胚胎组织、胎盘及妊娠期子宫内膜中呈高表达[4]。PIGF是一种分泌型同源二聚体糖蛋白，属于VEGF家族，其碱基序列与VEGF同源性高，通过特异性结合血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1)/fms样酪氨酸激酶受体-1(Flt-1)受体发挥与VEGF相似的生物学功能[5]。研究报道，正常妊娠时，随妊娠进展血清中PIGF水平呈峰形，健康孕妇血清PIGF妊娠过程中的变化：孕5～15周PLGF水平低，15-26周PIGF表达迅速增加，在妊娠28～30周达高峰，检测PIGF水平可用于评估胎盘功能及子痫前期发生风险及危险分层[6]。郑海娜等[7]研究报道，孕早期子痫前期孕妇血清PIGF水平显著低于正常健康孕妇，且子痫前期血清PIGF水平随病情严重程度增加而降低。本研究结果发现，与对照组比较，自然流产患者绒毛膜组织PIGF mRNA及蛋白、血清PIGF水平均显著降低，提示PIGF表达降低可能与孕早期自然流产发生有关。miRNA在真核生物中经Dicer酶加工后形成小分子RNA，具有高度保守型、时序性和组织特异性。mir-125家族进化过程中非常保守，由mir-125a、mir-125b-1、mir-125b-2三个成员组成，mir-125家族异常表达与肿瘤发生发展、侵袭转移及预后密切相关[8]。Nie等[9]研究研究发现，mir-125b在三阴性乳腺癌组织及细胞系中表达水平均显著高于正常乳腺组织及细胞系，下调mir-125b可通过调控Wnt/β-catenin通路及上皮细胞间质转化过程抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。李建华等[10]研究报道，mir-125在肝癌组织及细胞系中表达下调，且在肝癌细胞中，甲基化抑制剂可显著上调其表达。本研究结果发现，mir-125b在自然流产患者绒毛膜组织、血清表达水平显著增加，与李建华[10]在肝癌中的结果不符，可能miR-125b在不同疾病中表达模式不同，本研究发还发现mir-125b与PIGF蛋白水平呈负相关，提示mir-125b表达水平上调可能通过抑制PIGF表达，与自然流产发生有关，但具体机制有待进一步探索。本研究还发现，血清mir-125b、PIGF水平预测孕早期自然流产发生的AUC分别为0.896、0.884，mir-125b≥1.630预测自然流产发生的灵敏度为95.30%，特异度为84.60%，PIGF≤42.553pg/mL预测自然流产发生的灵敏度为90.60%，特异度为77.90%；二者联合检测AUC高达0.954，特异度高达92.30%，但灵敏度略下降，提示检测血清mir-125b、PIGF水平对孕早期自然流产发生有一定预测价值，灵敏度有待提高。

综上所述，早期自然流产孕妇绒毛膜组织中mir-125b水平上调，PIGF水平下调，且二者呈负相关，可能对自然流产发生有一定预测价值。但由于本研究样本量少，存在不足，另关于mir-125b与PIGF在自然流产患者中是否存在靶向调控关系及具体机制、涉及相关通路及联合诊断的最佳阈值有待进一步深入探索。