翻译起始因子 eIF3A 调控喉癌顺铂敏感性的试验研究

郭龙梅，徐雪媚，蔡勋功，赵 东，周 彬

(哈尔滨医科大学附属第四医院 耳鼻咽喉科，黑龙江 哈尔滨150001)

顺铂是喉癌化疗中的常用药物，然而众多的患者存在耐药现象，寻找药物敏感性的分子标志物对临床治疗具有重要意义[1]。已有研究发现翻译起始因子 eIF3A 可能与头颈部肿瘤细胞的顺铂敏感性有关[2]，在本研究中我们验证其对喉癌细胞顺铂敏感性的调节作用，探讨其作为顺铂敏感性分子标志物的可能性。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

BPN红外CO2细胞培养箱(成都泰盟科技有限公司)、721型分光光度计(成都泰盟科技有限公司)、ABI 3900台式DNA合成仪(美国应用生物科技公司)、ABI 9700 PCR仪(美国应用生物科技公司)、ABI 7500全自动荧光定量PCR仪(美国应用生物科技公司)、光学显微镜(日本奥林巴斯公司)等。

1.2 主要试剂及药品

顺铂(齐鲁制药有限公司；批号：040806)、MTT(sigma公司)、DMSO(sigma公司)、DEPC(南京建成生物工程研究所)、Trizol(南京碧云天生物科技公司)、dNTPs(南京碧云天生物科技公司)、MMLV(南京碧云天生物科技公司)、Taq酶(北京奥科生物科技公司)、TUNEL原位末端标记检测试剂盒等。

1.3 实验方法

1.3.1细胞的分组及处理 喉癌Hep-2细胞分为处理组及对照组，处理组细胞过表达eFI3A，处理方法如下：(1)克隆eIF3A CDs区克隆到慢病毒载体pLVSIN CMV Puro上。(2)将构建好的穿梭质粒与包装质粒同时转染293T包装细胞获得过表达eFI3A的慢病毒以及对照空病毒。(3)利用制备好的慢病毒感染Hep-2细胞24 h后换液，感染48 h后添加适量嘌呤霉素进行稳转eFI3A Hep-2细胞以及对照Hep-2细胞的筛选。筛选48 h后获得的稳转细胞株利用含嘌呤霉素(筛选浓度的一半剂量)维持培养[3]。

1.3.2细胞的培养及干预 对两组Hep-2细胞进行同条件培养，采用1640培养液，其中加入胎牛血清、青霉素、链霉素。观察细胞生长，去除死细胞。细胞传代至对数生长期后采用同等量的顺铂溶液对两组细胞进行干预，顺铂浓度为40 mg/L[4]。

1.3.3细胞生长抑制率检测 选择对数生长期的Hep-2细胞进行生长抑制率检测，配备成5×104/ml的悬浮液后接种到96孔板上，细胞培养贴壁后清洗换液，加入培养基及处理液，使其浓度梯度为10、20、40、80及160 mg/L。再次培养24及48 h吸干孔中原液后加入MTT溶液，继续培养4 h后吸取原液并于每个孔中加入二甲基矾，混匀后使用自动酶标仪于570 nm处测量a值。抑制率(fa)=(1-实验组平均A值/空白组平均A值)×100%[5]。

1.3.4细胞总RNA提取 培养5天后从无菌室取出各组细胞并弃掉上清液，按相关流程依次加入Trizol、氯仿并孵育及离心，加入异丙醇离心后再经乙醇处理，再次离心去掉上清液得到白色沉淀，真空干燥后通过DEPC处理过的水溶解RNA，最后加入2.5倍体积的75%的乙醇溶液，在-80℃下储存备用[6]。

1.3.5mRNA引物合成

在 GenBank上查找目的基因mRNA序列，特异性引物采用 Primer express2.0软件进行跨内含子设计，引物的合成使用的仪器是ABI3900台式DNA合成仪[7]，序列如下：Survivin序列(扩增片段 AACAGCGACACCCACTCCTCCACC，长度129 bp),Forward primer：5′-AAC ACT GCT GCT GTG GAC CCT ACT-3′;Reverse primer：5′-GAC AAC TGC GTC TCTG-3′。Caspase3序列(扩增片段，长度101 bp)，Forward Primer：5′-AGT GGA GGC CGA CTT CCT GTA-3′;Reverse primer 5′-TGG CGC AAA GTG ACT GGA T-3′。

1.3.6实时定量检测 将上述提取的RNA用于逆转录反应，使用反向缓冲液、下游引物、DNPS、MMLV、DEPC等作为反应体系。进行定量PCR并依次使用标准曲线定量法、凝胶电泳法，通过测量OD260确定阳性标准并建立标准品梯度。在含有SYBR Green I PCR缓冲液、Taq酶、cDNA、ddH2O、dNTP、上游引物f及下游引物R的反应体系中对样品及阳性标准品进行PCR反应，在各相应温度下按相关规程共进行40个循环[8]。

1.4 统计学分析

采用SPSS17.0处理所有数据，多组符合正态分布的定量使用方差分析进行数据统计，多组之间两两比较采用SNK-q检验进行组间比较，以P<0.05认为差异具有显著性。

2 结果

2.1 各组喉癌Hep-2细胞生长抑制情况的比较

细胞培养24 h后，处理组及对照组细胞生长抑制率分别为25.6±5.8及4.1±0.3，差异具有统计学意义(P<0.001)；细胞培养48 h后，处理组及对照组细胞生长抑制率分别为51.4±7.5及4.0±0.4，差异具有统计学意义(P<0.001)。见表1。

表1 各组喉癌Hep-2细胞生长抑制情况

2.2 各组喉癌Hep-2细胞 Caspase3 mRNA及Survivin mRNA的表达情况

细胞培养5天后，处理组及对照组细胞 Caspase3 mRNA表达水平分别为1.93±0.27及0.84±0.14，差异具有统计学意义(P<0.001)；处理组及对照组细胞 Survivin mRNA表达水平分别为0.52±0.14及1.34±0.17，差异具有统计学意义(P<0.001)。见表2。

表2 各组喉癌Hep-2细胞 Caspase3 mRNA及Survivin mRNA的表达

3 讨论

喉癌是耳鼻咽喉科较常见恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈现明显上升趋势，目前以手术为主的综合疗法仍是喉癌的主要治疗模式[9]，化疗就是其中尤为重要的辅助治疗手段，而顺铂是喉癌化疗中较为敏感和最为常用的药物[10]。研究显示在喉癌化疗中无论单独用药或者联合用药、术前用药或者是术后用药，顺铂都表现出了良好的疗效，然而也有众多的喉癌患者表现出了对顺铂的耐药性[11]。因此，寻找顺铂敏感性的分子标志物，增加肿瘤组织对顺铂的敏感性，对于喉癌的治疗具有重大的意义。

eIF3是哺乳动物细胞中最复杂的真核起始因子，其分子量为550-700 kDa，由13个亚基组成，在细胞生长和细胞周期的调控中起重要作用[12]，eIF3A是eIF3中最大的亚基。eIF3A在人体正常组织中不表达或表达很低，而在乳腺癌、食管癌、宫颈癌、肺癌、胃癌、结肠癌等肿瘤组织中高表达，由此推测eIF3A可能与肿瘤的恶性转化有关[13]。已有研究表明eIF3A与鼻咽癌等头颈部肿瘤的顺铂敏感性有关[14]，在本研究中我们检验了其在喉癌顺铂化疗中的作用。我们的研究结果显示，相比于对照组，在eIF3A高表达的喉癌细胞株中应用顺铂后细胞增殖明显受到抑制，说明该类细胞株对顺铂的反应性明显增强。

Caspase3是半胱氨酸蛋白酶家族成员，又称细胞凋亡因子，它能够通过多种途径促进细胞的凋亡，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的最终效应因子[15]。Survivin又称为细胞增殖因子，它能够通过多种途径对细胞的凋亡及增殖进行调控，来发挥促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用，其中也包括对 Caspase-3蛋白活性的抑制[16]。这两个因子能够调控肿瘤的活性，因此其表达的高低能够作为评估抗肿瘤方案敏感性的指标[17]。我们的研究结果发现，相比于对照组，处理组细胞 Caspase3 mRNA表达水平升高，Survivin mRNA表达水平降低。这说明eIF3A的高表达可能影响了Caspase-3及Survivin的活性，协同促进了喉癌细胞的凋亡，从而发挥了增加顺铂敏感性的作用，我们会在后续的试验中对其机制进行更加深入的研究。

综上所述，eIF3A的高表达能够明显增加喉癌Hep-2细胞对顺铂的敏感性，并影响了Caspase3 mRNA及Survivin mRNA的表达。相信随着研究的不断深入，eIF3A有望成为喉癌顺铂敏感性的重要分子标志物，为喉癌的化疗发挥重要的指导作用。