3种分子新诊断技术与传统培养技术检测结核分枝杆菌阳性率比较

刘兰瑞,张永强,张 原,马 倩,赵凤芹

(1.保定市第五医院,河北 保定071000;2.保定市疾病预防控制中心)

目前，结核病疫情仍然居高不下，耐药结核病的流行肆虐全球，其根源乃传染源作祟，消除传染源是控制结核病的关键[1]。而过去很长时间仅仅依靠痰涂片检测，阳性发现率低。近年来，以LAMP等为代表的新诊断技术的不断涌现为结核病的诊断提供了新的手段。本研究对活动性肺结核的患者痰标本分别采用Xpert MTB /RIF、LAMP、CPA技术和罗氏固体培养法4种在本地区常用的检测方法进行检测，评价4种技术在结核菌阳性检测率方面的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2019年1-6月保定市级结核病定点医院收治的488例活动性肺结核患者(男336 例，女152例，平均年龄42.6 岁)，每人送检1份合格痰标本，共488份，其中涂阳标本176例，涂阴标本312例。

1.2 仪器与试剂Xpert MTB/RIF检测仪(美国Cepheid公司)，恒温荧光检测仪(广州华峰生物科技有限公司)；XpertMtb/RIF试剂盒(批号：1000147334)；、TB-LAMP 扩增试剂盒(日本荣研株式会社,批号：8Z002)；CPA检测试剂盒(杭州优思达生物技术有限公司，批号：20181103)；酸性罗氏培养基(珠海贝索有限公司，批号：20181220)。

1.3 方法

1.3.1固体培养[2]痰标本采用NALC-NaOH前处理法，视标本性状，加1-2倍体积的处理液于无菌痰杯中，使痰液充分液化，在20 min内接种2支酸罗氏培养基。

1.3.2LAMP检测 经4%NaOH液痰标本预处理后12 000 r/min离心取沉淀，加DNA提取液，制备DNA模板，加入阴性对照、待检模板和阳性对照65 ℃恒温扩增60 min,加显色液判读结果，绿色为阳性，橙色为阴性。

1.3.3Xpert MTB/RIF检测：视痰标本性状，加入1-2 ml的Xpert MTB/RIF处理液，振荡30 s，静置15 min，吸取2 ml处理后的样本加入Xpert MTB/RIF反应试剂盒中，上机检测自动判读。

1.3.4CPA检测 待检痰标本中加4%NaOH处理后静置20 min。取1 ml液化后痰液离心弃上清。加DNA提取液，沸水浴10 min，冷却后取上清液备用。取试剂管，加复溶液和石蜡油，室温静置后加入DNA模板,瞬时离心后置恒温设备63℃扩增60 min，置核酸检则装置内检测。判读结果：检测线和质控线同时出现，为阳性；仅出现质控线，为阴性。

1.4 统计学处理使用SPSS17.0建立数据库进行统计学分析,率或构成比的比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义,3种分子检测的一致性评价采用Kappa检验。

2 结果

XpertMTB/RIF、LAMP、CPA、固体培养4种检测方法的总阳性率依次为59.84%，58.20%，56.56%，44.06%；在涂阳患者中XpertMTB/RIF、LAMP、CPA 3种分子阳性率依次为98.86%，98.30%，97.16%，高于固体培养法94.32%；在涂阴患者中阳性率依次为37.82%，35.58%，33.65%，高于固体培养法15.71%；以上差异均有统计学意义(χ2=30.58,7.82,45.19；P<0.05)。LAMP与XpertMTB/RIF检测的一致率为98.36%(480/488)，Kappa值=0.966；CPA与XpertMTB/RIF检测的一致率为95.90%(468/488)，Kappa值=0.916。见表1。

表1 不同方法检测结核分枝杆菌阳性率比较

3 讨论

痰涂片染色镜检法及传统固体培养法是临床结核病检验中应用最普遍的方法。目前，尽管涂片和痰培养检测MTB具有许多缺点，但涂片价格低廉且操作方便，固体培养可提供后续的药敏试验菌株并进行分子流行病学分析，故仍作为常规方法使用[3]。分子新诊断技术快速发展为结核菌检验提供了新的途径，不仅缩短了检测时间，而且提高了检测效能。

病原学阳性检出结果受多种因素影响[4]，诸如标本质量、含菌量、检测方法灵敏性、操作熟练程度等。本研究加强了实验前后质量控制，采取合格标本，保证标本质量，严格操作程序。研究显示，痰涂片检查阳性率仅为36.07%，固体培养法阳性率44.06%，Xpert MTB /RIF、LAMP、CPA 3种分子诊断技术表现了良好的检测效能，阳性检出率分别达到了59.84%，58.20%，56.56%，大大提高了阳性检出水平。以上表明，痰涂片镜检法及固体培养法的灵敏度仍不及分子诊断技术。一般涂片检查菌数需5000个/ml-10000个/ml，培养需100个/ml，标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果[5]。而3种分子技术只需要标本中有极微量的结核杆菌就能检测出来。有研究CPA诊断肺结核的敏感度和特异度分别为83.33%和95.12%[6]，邱勇[7]研究CPA的敏感度与特异度分别为89.7%(95%CI:78.8%-96.1%)与92.9%(95%CI:87.7%-96.4%)。张青[8]等综合25 篇文献进行分析，LAMP、Xpert诊断肺结核的合并敏感度分别为93%(95% CI：92%-95% )和96%(95%CI：94%-98% ),特异度分别 88%(95%CI：85%-9O%)和98%(95%CI：98%-99%)。

Xpert MTB /RIF总阳性率高于LAMP及CPA，与Xpert MTB /RIF比较，LAMP及CPA分子检测和Xpert MTB /RIF检测的一致性较好，Kappa值分别为0.966和0.916。3种分子技术与培养法比较，本研究中也出现了培养阳性而分子诊断阴性的情况，LAMP检测2例、Xpert MTB/RIF检测2例、CPA检测3例，可能原因有试验所取标本中没有结核分枝杆菌，也可能是标本中含有TaqDNA聚合酶的抑制物等[9,10]。

分子检测技术在结核病病原学诊断中成为传统技术的有力补充，检出时限上，LAMP、Xpert MTB /RIF、CPA分别用时约1 h、2 h、2 h，远小于固体培养法的30 d，3种分子技术适用于结核病的早期诊断。姜世闻[11]建议通过使用分子生物学检测技术优化肺结核患者的筛查和诊断流程，规范实验室操作规程，有望提高我国肺结核患者的病原学阳性检出率。