囊胚评估参数对冻融周期临床结局及移植选择的影响

朱序理，赵志明，杜元杰，周亮，王跃，孙庆云，曹金凤，郝桂敏

(河北医科大学第二医院生殖医学科，石家庄 050000)

体外受精技术的主要挑战和目标是培养和选择出最具有种植潜能的胚胎，使母胎共同得到最好的临床结局。为了降低围产期产科及新生儿科的并发症，许多中心采取单囊胚移植来降低多胎妊娠，但由于各中心囊胚冷冻标准及策略不同，以及囊胚形态学评分存在主观性因素等，关于囊胚不同的评估参数对临床妊娠结局的预测权重存在诸多争议[1-2]。因此，本研究旨在通过分析囊胚的形态学评估参数与冻融胚胎临床结局的关系，探讨囊胚形态学参数中对囊胚冻融周期临床结局的主要影响因素，为胚胎冷冻、解冻、移植等策略提供依据。

资料与方法

一、研究对象及分组

回顾性分析2018年1月至2020年2月在河北医科大学第二医院生殖医学科行D5或D6单囊胚冻融胚胎移植的患者临床资料。纳入标准：(1)冷冻囊胚为D5或D6、扩张期为3期及以上，囊胚内细胞团与滋养层细胞评分不同时为C；(2)冻融周期采用人工周期内膜准备方案；(3)解冻后为存活囊胚，移植时扩张程度大于50%以上，且为单囊胚移植；(4)排除行PGT周期。

共纳入790个移植周期，分别按发育天数、囊胚扩张程度、内细胞团级别、滋养层细胞级别分组比较。按发育天数分为D5组(n=650)和D6(n=140)组；按囊胚扩张程度分为6期组(n=45)、5期组(n=57)、4期组(n=585)和3期组(n=103)；按滋养层细胞评分分为A1组(n=35)、B1组(n=613)和C1组(n=142)；按内细胞团评分分为A2组(n=51)、B2组(n=652)和C2组(n=87)。

二、研究方法

1.囊胚培养：按照本中心常规操作，在受精后D5、D6胚胎观察，达到囊胚冷冻标准，进行玻璃化冷冻。囊胚冷冻标准：D5或D6为3期及以上的囊胚，内细胞团(ICM)和滋养层细胞(TE)级别评分不同时为C级，即评分为AA、AB、AC、BA、BB、BC、CA、CB。

2.囊胚评分：采用Gardner囊胚评分系统[3]，囊胚扩张程度：1期(早期囊胚)；2期(囊胚)；3期(完全囊胚)；4期(膨大囊胚)；5期(孵化囊胚)，6期(孵出囊胚)。ICM的评分分为：A：紧密堆积的ICM，有许多细胞；B：松散组合的，有几个细胞；C：很少细胞，排列紊乱。TE的评分分为：A：许多细胞形成一个内聚的上皮；B：少数细胞形成一个松散的上皮；C：很少有大细胞。

3.囊胚冷冻及解冻：冷冻前行激光人工皱缩。玻璃化冷冻和解冻采用商品化试剂盒(Kitazato，日本)按照Kuwayama[4]报道的Crytop方法步骤进行，解冻最后在培养液中清洗数遍最后转移至已平衡过夜囊胚培养液(G-2plus，Vitrolife，瑞典)中，放入37℃，6%CO2的培养箱内，囊胚移植前根据扩张程度重新判断胚胎是否存活。

4.人工周期内膜的准备：从月经周期第3天给予口服戊酸雌二醇(补佳乐，拜耳，德国)2～4 mg，2次/d，根据患者的内膜情况调整用药剂量，待子宫内膜厚度≥8 mm及血清E2≥732 pmol/L时进行内膜转化，给予肌肉注射黄体酮(黄体酮注射液，浙江仙琚)40 mg，1次/d，或阴道给药90 mg(雪诺酮，雪兰诺，英国)，1次/d，行黄体支持。记录内膜形态及厚度。

5.囊胚移植：解冻移植根据囊胚冷冻前发育天数和扩张程度准备，发育天数为D6的5期、6期囊胚按D6准备，即黄体转化的第7天解冻移植，发育天数为D5、D6的3期、4期囊胚按D5准备，即黄体转化的第6天解冻移植。移植囊胚数目均为1枚。

6.临床妊娠判定：移植后12 d检测血β-HCG，血HCG≥50 U/L为HCG阳性；移植4～5周行超声检查可见妊娠囊及原始心管搏动确定为临床妊娠。记录孕囊数目。

7.分类决策树建模：采用SPSS 23.0软件卡方自动交互检验(CHAID)，指定项：以是否临床妊娠为因变量，以发育天数、扩张时期、内细胞团、滋养层细胞为自变量，年龄为影响变量。使用生长法，在每一步CHAID选择与因变量有最强交互作用的自变量，如果自变量的类别与因变量并非显著不同，则合并这些类别。从开始生成两个分区，在每个分区中执行相同的过程，直到没有变量向树添加值，建立分类决策树模型。

三、统计学处理

结 果

一、胚胎发育天数对妊娠结局的影响

D5和D6两组患者的体重指数(BMI)、不孕年限、内膜厚度、内膜类型之间差异均无统计学意义；D6组平均年龄显著高于D5组，而临床妊娠率显著低于D5组(P<0.05)(表1)。

表1 D5与D6患者的一般情况及临床妊娠结局比较[(-±s)，%]

二、囊胚扩张程度对妊娠结局的影响

按囊胚扩张程度(6期、5期、4期、3期)分组的4组患者在平均年龄、体重指数、不孕年限、内膜厚度、内膜类型临床妊娠率差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

三、滋养层细胞评分不同患者间妊娠结局比较

统计结果显示，滋养层细胞评分不同的3组患者在平均年龄、体重指数、不孕年限、内膜厚度、内膜类型的差异均无统计学意义；3组患者的临床妊娠率随滋养层细胞评分下降逐渐降低(P<0.05)(表3)。

四、内细胞团级别不同患者间妊娠结局比较

统计结果显示，内细胞团评分不同的3组患者在平均年龄、体重指数、不孕年限、内膜厚度、内膜类型差异上均无统计学意义；3组患者的临床妊娠率随内细胞团级别评分下降逐渐降低(P<0.05)(表4)。

表2 囊胚扩张程度不同的患者一般情况及临床妊娠结局比较[(-±s)，%]

表3 滋养层细胞评分不同的患者一般情况及临床妊娠结局比较[(-±s)，%]

表4 内细胞团评分不同的患者一般情况及临床妊娠结局比较[(-±s)，%]

五、影响临床妊娠结局的多因素logistic回归分析结果

Logistic回归分析结果表明，年龄[OR=0.945，95%CI(0.913，0.979)]和内细胞团等级[OR=0.527，95%CI(1.213，2.475)]与临床妊娠结局显著相关(P<0.05)；而发育天数、扩张程度、滋养细胞等级与临床妊娠结局无关(P>0.05)(表5)。

表5 影响妊娠结局多因素回归分析

六、分类决策树模型结果

模型中纳入的自变量为扩张时期、内细胞团和滋养层细胞级别；结果显示决策树包含3层，共生成6个节点：(1)第一层为内细胞团(C级 vs A，B级；χ2=13.7，P=0.001)；(2)第二层为扩张时期(6，3期 vs 4，5期；χ2=11.1，P=0.006)；(3)第三层为滋养层细胞(C级 vs A，B级；χ2=6.367，P=0.035)；交叉验证正确百分比57.8%(图1)。

注：Adj.表示调整后统计值，n表示周期数，节点1为内细胞团为C级的囊胚，节点2为内细胞团为A或B级的囊胚，节点3和节点4为节点2的子节点分别为扩张期(6期，3期)和(5期，4期)囊胚，节点5和节点6为节点4的子节点分别为滋养层细胞(A，B级)和C级囊胚。图1 分类决策树

讨 论

近年来随着囊胚培养技术的发展，选择性囊胚移植为临床策略提供了更多的方案，且获得较高的临床妊娠率。囊胚移植提高妊娠率的同时，多个囊胚移植，多胎率也高，因此很多生殖中心采用单囊胚移植，在保证妊娠率的同时降低多胎率。但囊胚目前形态学评分的参数包括囊胚发育天数、扩张期别及滋养层细胞和内细胞团的级别等，如何挑选更具有发育潜能的囊胚，从而缩短到达临床妊娠的时间，成为各中心的需要解决的问题。而且，目前各中心通常采用Gardner囊胚评分方法[3]，胚胎扩张程度、内细胞团、滋养细胞这三者之间具有相对独立性，各参数对临床结局的影响，国内外文献报道存在争议[5-8]，因此，移植时给囊胚选择带来一定困惑。

新鲜周期中临床妊娠和胚胎种植的影响因素很多，包括卵巢刺激造成的高水平的雌激素或提前的孕激素的升高等对内膜容受性的影响，因此在本研究中我们对冻融的单囊胚移植周期进行回顾性分析，采用人工周期内膜准备方案，以期将激素对内膜的影响降至最低，探讨囊胚的各项评估参数与冻融周期临床结局的关系，为冻融胚胎移植策略提供依据。

发育天数D5与D6囊胚临床妊娠结局的比较目前仍存在争议，主要由于培养体系，囊胚培养及冷冻时间策略等不同造成研究结果存在差异[9]。本研究发现，发育天数D5组临床妊娠率显著高于D6组，但年龄显著低于D6组(P<0.05)；多因素回归分析发现，发育天数与临床妊娠率无相关性，而且分类决策树指定项加入了发育天数为自变量，结果中也没有发育天数这一节点。这可能是与本中心囊胚培养及冷冻标准等策略有关，囊胚冷冻的标准为D5和D6囊胚评级在3 CC以上，D6为囊胚培养终点，因此，D6可能有一部分6期囊胚和非优质囊胚，而且6期囊胚由于没有透明带保护，可能在冷冻复苏过程受到影响。此外有研究表明优质囊胚发育天数为D5和D6整倍体率差异没有统计学意义，但非优质囊胚发育天数为D5整倍率明显高于D6[10]，非优质囊胚的发育速度与整倍体有相关性，从而影响临床妊娠结局。这与何于夏等[11]的研究相似，在非优质单囊胚中D5比D6有较好的临床妊娠率。因此，如果在本研究基础上非优质囊胚进一步分枝，可考虑囊胚发育速度，进一步证实可通过队列前瞻性研究。

本研究发现，囊胚扩张程度与临床妊娠率没有相关性，这与既往一些报道一致[8，12-13]。但本研究结果显示6期和3期囊胚临床妊娠率有下降趋势，且分类决策树分两区显示6期和3期囊胚临床妊娠率显著低于5期和4期囊胚。分析可能由于在囊胚冷冻复苏中受到影响，6期囊胚由于没有透明带保护，3期囊胚由于激光皱缩效果欠佳或是受损细胞相对比例高。因此提示我们在囊胚培养过程中，通过增加观察次数，避免冷冻6期和3期囊胚，冻融移植时优先选择5期和4期囊胚。

关于内细胞团和滋养层细胞级别对临床结局的相对贡献尚未确定，考虑到内细胞团分级包含胎儿细胞的前体细胞，最初可能认为其对移植结果的影响最大，早期一些研究也表明内细胞团等级比滋养层细胞等级更重要[13-14]。但近几年国外一些报道，认为滋养层细胞是成功妊娠的最重要决定因素[1-2，15]。从生理学角度来看，滋养层细胞和内细胞团不是孤立存在的，而是作为一个有机整体共存的。滋养层细胞通过囊胚腔液的合成为内细胞团创造了一个独特的环境[16]。早期在小鼠囊胚研究中发现内细胞团本身可通过抑制巨细胞转化和刺激细胞增殖调节滋养层细胞[17-18]。因此，对囊胚的内细胞团和滋养层细胞进行分级，并在移植时挑选最具发育潜能的囊胚，从而得到更好的临床结局具有重要的意义。本研究发现内细胞团、滋养层细胞评分不同的各组临床妊娠率不同，且差异有统计学意义。多因素logistic分析显示，内细胞团评分低是临床妊娠率低的危险因素，且分类决策树第一节点为内细胞团级别，A、B级与C级比较临床妊娠率有显著性差异(χ2=13.7，P=0.001)，因此，我们认为在单囊胚移植策略中首先要考虑内细胞团等级。这也与李为玉等[8]的报道相一致，内细胞团评分低的相对风险值更高。何于夏等报道[11]，在非优质单囊胚移植周期中，优先选择D5囊胚，可获得较好的临床妊娠率与活产率，囊胚内细胞团、滋养细胞层的评分不平行时，即相同囊胚发育速度下AC/BC组与CA/CB组相比，不影响妊娠结局。按照本研究中分类决策树提供的的临床参考，在选择囊胚移植时，应首先根据内细胞团排除C级，再根据扩张程度排除6期和3期，最后根据滋养层细胞排除C级。本研究包括了非优质和优质囊胚，因此对于非优质或优质囊胚单独比较囊胚形态学参数权重还需进一步研究。王雪等[19]报道优先选择D5优质胚，该中心只冷冻4期以上囊胚且内细胞团为A或B级，因此，不同中心根据自己中心常规操作，建立移植策略是必要的。

本研究中分类决策树模型交叉验证正确率低于60%，主要因为胚胎移植后临床结局影响因素不仅有胚胎发育速度及质量，还有女性的年龄、内膜厚度、不孕年限、不孕原因等，此外患者子宫内环境、机体免疫状态、移植过程等均对妊娠的成功有影响。本模型建立的初衷是利用胚胎形态学主要参数提供有效移植策略，从而提高患者的移植效率，但还具有一定的局限性。

综上所述，在冻融单囊胚移植周期中，囊胚评估参数内细胞团评分低是临床妊娠率低的主要危险因素；单囊胚的冻融周期移植时，建议优先考虑内细胞团级别，选择A或B级的囊胚，再考虑扩张程度为5或4期的囊胚，最后考虑滋养层细胞级别为A或B级的囊胚，从而获得较高临床妊娠率。