两种宫腔灌注治疗对薄型子宫内膜患者的疗效对比观察

龙惠东，王凤，吴迪，邓伟芬，黄玉群，李宇彬

(1.东莞广济医院生殖中心，东莞 523000；2.中山大学附属第一医院，广州 510000；3.深圳恒生医院，深圳 518000)

随着辅助生殖技术的快速发展，体外受精-胚胎移植术(IVF-ET)已成为治疗不孕症的重要助孕方法。除了胚胎质量外，子宫内膜因素是影响IVF-ET成功的一大重要因素，临床上常见由于反复宫腔操作导致子宫内膜炎症、粘连，或不明原因的内膜变薄，降低了IVF-ET的周期妊娠率。如何改善薄型子宫内膜患者的内膜厚度及临床结局，是生殖医学工作者所关注的热点与难点。宫腔灌注是临床上治疗薄型子宫内膜的常用方法，主要有粒细胞集落刺激因子(G-CSF)宫腔灌注治疗，以及近年来报道的富血小板血浆(PRP)宫腔灌注治疗。不同的灌注物之间是否存在治疗效果差异尚未有定论。本研究拟探讨PRP与G-CSF宫腔灌注对薄型子宫内膜患者行IVF助孕临床结局的效果，以选择更优的方法用于临床治疗。

材料与方法

一、研究对象

2018年7月至2020年3月在东莞广济医院生殖中心行冻融胚胎移植的薄型子宫内膜患者。

纳入标准：年龄≤38岁；既往至少两次自然排卵周期或促排卵周期卵泡成熟时内膜厚度≤7 mm，或激素替代人工周期(HRT)准备子宫内膜时，雌激素持续用药12 d时内膜厚度≤7 mm；本次移植至少有1个为优质胚胎。

排除标准：既往有肿瘤病史；合并巨大子宫肌瘤(直径>4 cm)；严重子宫腺肌病患者；对G-CSF过敏者。

共纳入229例患者。患者知情同意后采取随机数字表随机分为3组：80例接受PRP宫腔灌注治疗(PRP组)，81例接受G-CSF宫腔灌注治疗(G-CSF组)，68例接受生理盐水宫腔灌注(对照组)。

本研究经东莞广济医院生殖中心医学伦理委员会批准。

二、治疗方案

1.子宫内膜准备方案及内膜测量：对月经周期规则、有正常排卵的患者选择自然或促排卵周期方案或HRT方案；对无正常排卵患者选择HRT方案。

HRT方案：于月经第2～3天开始口服戊酸雌二醇(补佳乐，拜耳，德国) 4～8 mg/d，并根据内膜及血激素水平调整剂量，雌激素持续用药12～16 d及雌二醇水平>734 pmol/L时予以内膜转化，转化日开始给予黄体支持用药。

胚胎移植当日检测子宫内膜厚度及内膜血流，内膜测量值均在两名超声医生的核对后得出结果。检测到内膜和内膜下均无血流为A级内膜，仅检测到内膜下有血流为B级内膜，内膜和内膜下均检测到血流为C级内膜[1]。

2.PRP的制备：全程严格执行无菌操作，制作方法参考文献报道[2]：抗凝管抽取患者肘静脉血15 ml，留取1 ml全血进行血小板(PLT)计数，剩余14 ml全血进行PRP制备：将血标本放进2个离心管中，215g离心10 min；离心后的标本吸取全部上清、白膜层及以下2 mm的红细胞层转移到新的离心管中进行第2次离心，863g离心10 min；后弃掉3/4上清液剩余约1.0 ml吹打均匀即PRP。留取0.2 ml计数PLT，全自动血液分析仪(Siemens Advia 2120i，德国) 计数全血及 PRP中的PLT数量。

3.宫腔内灌注：自然周期或促排周期中优势卵泡约12 mm时或HRT周期用药第8天子宫内膜厚度≤6 mm时，在PRP组给予PRP宫腔内灌注1次，G-CSF组给予G-CSF(惠尔血，协和发酵麒麟，日本)300 μg(0.7 ml)宫腔内灌注1次，对照组予生理盐水0.7 ml宫腔灌注；在转化日再次给予宫腔灌注以强化治疗效果。

宫腔灌注操作：常规消毒铺巾下，患者采取膀胱截石位，用人工授精管(COOK，美国)抽吸0.8 ml患者自体PRP(PRP组)或G-CSF 300 μg(G-CSF组)或0.7 ml生理盐水(对照组)，在腹部超声引导下经宫颈插入宫腔，看到管尖在宫腔中部时，将灌注液在无阻力下缓慢注入宫腔，将液体全部推入宫腔后缓慢外退管芯后完成，术后患者平卧休息30 min。

4.胚胎解冻移植及黄体支持：胚胎解冻后对胚胎进行评分，移植2枚卵裂期胚胎或1枚囊胚，卵裂胚至少有1枚为优质胚胎(7～9细胞，碎片率<30%的I级或II级胚胎)。3组黄体支持方案统一为：地屈孕酮片(达芙通，苏威制药，荷兰)20 mg 2次/日口服+黄体酮软胶囊(安琪坦，Besins，比利时) 200 mg 2次/日阴道给药。移植后14 d验血HCG值，移植后30 d超声下见妊娠囊定义为临床妊娠。

三、观察指标

患者一般资料；治疗前(前次移植日)、治疗后移植日内膜厚度及血流分级；平均移植胚胎数、胚胎种植率、临床妊娠率、早期流产率。胚胎种植率=(超声下孕囊个数/移植胚胎数)×100%，临床妊娠率=(超声下见孕囊例数/移植总例数)×100%，早期流产率=(孕12周前流产例数/临床妊娠例数)×100%。

四、统计方法

结 果

一、各组患者的一般情况比较

3组患者间年龄、不孕年限、既往人流次数、体重指数(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)、基础卵泡刺激素(FSH)、基础黄体生成素(LH)、基础雌二醇(E2)、基础孕酮(P)水平比较，差异均无统计学意义(P>0. 05)(表1)。

表1 三组患者一般情况比较 (-±s)

二、PRP组中PRP的制备情况

PRP的制备均在千级层流实验室无菌操作下进行，宫腔灌注术后均未出现感染等不良反应。PRP中PLT浓度为全血的3.16倍[(433.83±36.76)×109/L vs. (137.17±24.94)×109/L，P<0.001)]。

三、各组子宫内膜厚度及血流分级比较

3组间既往周期移植日(表2中定义为“治疗前”)的内膜厚度无显著性差异(P>0.05)；PRP组及G-CSF组治疗后移植日内膜厚度均较既往周期移植日内膜厚度显著增厚(P<0.001)，且显著优于对照组(P<0.001)(表2)。

灌注治疗后3组的内膜血流分级比较均有显著性差异(P<0.05)，PRP组及G-CSF组的B及C级血流患者比例显著高于对照组(P<0.05)(表2)。

四、各组胚胎移植及妊娠结局比较

3组间移植胚胎数、胚胎种植率、临床妊娠率、早期流产率比较差异均无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表2 三组患者宫腔灌注治疗前后移植日内膜厚度及血流分级[(-±s)，n(%)]

表3 三组间妊娠结局的比较[(-±s)，%]

讨 论

在辅助生殖技术中，子宫内膜厚度及内膜血流是评估子宫内膜容受性的常用指标，成功妊娠的理想内膜厚度是9～12 mm，内膜下血流丰富者有着更高的临床妊娠率[3]。有临床研究发现移植日的子宫内膜厚度低于7 mm者临床妊娠率仅有23.1%[4]，内膜菲薄一直是生殖医生所面对的棘手问题。近年来对薄型子宫内膜的处理有很多不同方法，如宫腔灌注治疗、血管活性药物(西地那非、阿司匹林等)、生物电刺激、雌激素补充、中药针灸及干细胞治疗等，宫腔灌注的药物可直接与内膜局部作用，是较多临床医生常选择的治疗手段，但不同的灌注药物该如何选择，不同的药物之间是否有明显差异值得探讨。本研究提示PRP或G-CSF宫腔灌注均可以改善子宫内膜厚度及内膜血流分级。

PRP宫腔灌注是治疗薄型子宫内膜近年来摸索的新方法。PRP中血小板的数目比全血中数目高3倍以上，且富含有多种生长因子，可诱导和调节细胞分裂、分化和增殖，自体PRP应用于口腔及骨关节外科，得到了良好的临床疗效[5]。PRP中高浓度的血小板被激活后能释放血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF) 等，通过脱颗粒方式结合到细胞膜表面，促进子宫内膜组织生长[6-7]，Bertrand-Duchesne等[8]报道PRP多种生长因子中，以EGF的作用较为重要，可促进体外培养的内皮细胞增长。近年来开始将PRP应用于薄型子宫内膜的患者，探讨应用PRP灌注改善IVF-ET治疗中薄型子宫内膜患者的临床结局[9-10]；国内也有报道PRP治疗提高患者的内膜厚度及IVF的临床妊娠率[11-12]。本研究结果提示PRP宫腔灌注后患者的子宫内膜厚度及内膜血流得到改善，但临床妊娠率与对照组没有显著性差异，可能是样本量不足的原因。

G-CSF是刺激骨髓造血细胞增殖分化的细胞因子，文献报道在女性生殖方面它也参与了子宫内膜的生长、发育，在人子宫内膜和母胎界面均有G-CSF及其受体的表达[13]，为近几年G-CSF在生殖医学的临床应用提供了理论依据。Gleicher等[14]首次报道应用G-CSF治疗薄型子宫内膜获得较好的妊娠结局，提示G-CSF可能具有促进子宫内膜细胞增生及刺激内膜血管网再生等作用。也有多项Meta分析指出宫腔内灌注G-CSF可促进IVF-ET周期子宫内膜生长并提高临床妊娠率[15-18]。G-CSF除了增加子宫内膜的厚度，还可改善子宫内膜的容受性，可能与其在子宫内膜的受体表达有关系[19-20]。本研究提示G-CSF宫腔灌注可以改善薄型子宫内膜患者的子宫内膜厚度及内膜血流，但临床妊娠率与对照组也没有显著性差异，可能是样本量不足的原因，有待进一步加大样本量深入研究。

两种灌注方法各有优缺点。PRP制作来源于自体的血清，不会发生血源性感染和诱发胚胎变态反应等问题，安全性已得到文献证实[5]。PRP灌注从外科应用引入到生殖科，其原理更侧重于促进增殖、修复、愈合的作用，其中的多种因子在体内缓慢释放，并且还富含纤维蛋白、纤维结合蛋白等纤维网络，促进细胞黏附，推测PRP灌注可能更适合于宫腔粘连等内膜损伤的薄型子宫内膜患者；采血收集PRP对患者有一定的创伤性，其制作比较繁琐而且对实验室无菌操作有一定要求，不同实验室操作标准的差异也可能影响其有效性。G-CSF灌注选用的是现有的成品药物，不需要特殊制备，应用相对简便，药品出厂经过严格质控更加安全，而且对患者是无创的，但可能存在极个别患者对药物过敏不能使用，而且理论上单一的生长因子对促进细胞增殖与修复的作用没有多因子的复合作用强，G-CSF可能对非病理性损伤的薄型子宫内膜更合适，将来可以进一步分类研究探讨。

本研究比较了PRP及G-CSF两种宫腔灌注方法在薄型子宫内膜患者中的治疗作用，为临床治疗提供了新的方法和思路。研究结果显示两种方法在提高薄型子宫内膜患者的内膜厚度及血流、改善临床妊娠率方面均无显著性差异，提示两种方法效果相似。G-CSF宫腔灌注由于其使用上的便捷性、安全性及无创性，可接受性更强，临床上可以推荐应用于薄型子宫内膜患者；而PRP宫腔灌注临床使用安全有效，在缺乏G-CSF药物时或对G-CSF过敏患者也不失为一种有效的治疗手段，临床上也可以根据患者情况和实验室条件进行选择。