子宫内膜癌拷贝数变异分析

张钏，郝胜菊，张庆华，周秉博，陈雪，冯暄，刘芙蓉，王晓黎，李富萍，刘亚利，刘青，马旭，曹宗富*

(1.国家卫生健康委科学技术研究所，北京 100081；2.北京协和医学院研究生院，北京 100730；3.甘肃省妇幼保健院医学遗传学中心，兰州 730050)

子宫内膜癌是妇科三大恶性肿瘤之一，约占女性全身恶性肿瘤的7%[1]。子宫内膜癌病死率较高，据统计，2015年，中国的子宫内膜癌新发病例约63 400例，死亡病例21 800例，死亡率约为34.4%[2]；2017年，美国的子宫内膜癌新发病例为63 230例，死亡11 350例，死亡率达到18.0%[3]。2013年，美国癌症基因组计划提出通过分子特征来对子宫内膜癌进行分型，并将子宫内膜癌分为POLE超突变组、微卫星不稳定高突变组、低拷贝数变异组及高拷贝数变异组。同年，Nature杂志发表研究报道称通过基因拷贝数变异(CNV)对子宫内膜癌进行重新分级，可能会影响患者的术后辅助治疗方案及疗效，从而为子宫内膜癌患者提供个体化的治疗提供依据[4]。

目前国内外关于子宫内膜癌的基因拷贝数变异研究仍然较少，本研究中我们对10例子宫内膜癌患者的癌组织及其癌旁组织进行拷贝数变异分析，以分析子宫内膜癌的拷贝数变异特点，为给患者提供个体化诊疗方案提供基础。

资料与方法

一、研究对象

收集2018年8月至2019年7月在甘肃省妇幼保健院确诊的10例子宫内膜样腺癌I期患者的癌组织与癌旁组织进行研究，患者平均年龄(54.3±6.72)岁，组织大小为0.5 cm×0.5 cm。排除其他肿瘤及疾病。所有患者均签署了知情同意书，本研究经甘肃省妇幼保健院伦理委员会批准，批准号：[2016]院伦审研第(4)号。

二、研究方法

1.基因组DNA提取：病理切片，经HE染色(图1)排除污染的组织进行DNA提取。应用北京天根公司(中国)生产的石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行。使用Nanodrop 2 000核酸定量仪(Thermo Scientific，美国)测定DNA纯度和浓度，OD260/OD280在1.8～2.0之间及DNA浓度>50 ng/μl为初筛合格的DNA样本。使用TE缓冲液将DNA浓度调整至50 ng/μl左右，-20℃保存。

A：癌组织 ×40；B癌旁组织 ×10图1 子宫内膜癌患者癌组织与癌旁组织HE染色

2.基因芯片检测：全基因组DNA拷贝数分析采用昂飞公司(Thermo Scientific，美国)的750 K基因芯片，该芯片包含550 000个检测拷贝数的探针位点及200 000个单核苷酸多态性(SNP)探针位点。除可以进行拷贝数检测外，还可以对杂合性缺失(LOH)和单亲二倍体(UPD)进行分析。实验操作按照文献报道的AffymetrixCytoScanTMAssay 的操作流程进行[5]。主要操作步骤为：初筛合格的基因组DNA经消化和连接后进行PCR扩增，产物进行2%琼脂糖胶电泳检测，5 V/cm 进行 45 min，将主要条带在150～2 000 bp的PCR产物使用磁珠法进行纯化，Nanodrop 2000核酸定量仪测定纯化后的PCR产物浓度，最后产物的浓度≥3.0 μg/μl，产物OD260/OD280在1.8～2.0之间为二次筛选合格的DNA样本；然后将二次筛选合格的DNA样本进行片段化，片段化后的产物经2%琼脂糖胶电泳检测，5 V/cm 进行 45 min，片段分布在25～125 bp之间的产物经Labeling 试剂标记后进行芯片杂交，杂交条件为50℃，60 转/min，16～18 h；芯片杂交好以后分别经过500 μl Stain Buffer 1、500 μl Stain Buffer 2 及800 μl Array Holding Buffer洗涤后进行数据扫描。

3.数据分析：通过ChAS软件(美国)对芯片扫描数据进行分析。当被检测数据的质量控制(Quality Control，QC)数据SNP-QC≥15.0、绝对对差中值(MAPD)≤0.25及Waviness-SD≤0.12时，说明被检测数据的质量高。MAPD表示相对于log2值的探针之间的距离。SNP-QC代表各个探针聚集的基因型簇之间的分离程度。Waviness-SD代表探针组之间的差异。这些质量控制指标可以评估SNP芯片检测数据的整体质量。根据人类基因组版本GRCh37(hg19)注释对微阵列数据进行解释。选择符合QC标准并CNV片段超过100 Kb和出现至少10个连续异常探针的区域进行进一步分析。根据log2值来判断拷贝数状态(copy state，CN)，CN=2为正常，CN=3为重复(duplication，dup)，CN=1为缺失(deletion，del)，当CN介于1～2或者2～3之间时代表存在嵌合缺失或者重复，根据CN的值来判断缺失或重复在癌组织标本中的比例。将检测出的CNV在DGV(http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、Decipher (https：//decipher.sanger. ac.uk/browser)、ClinVar (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)中进行对比，以排除健康人群中的多态性变异。

结 果

一、标本数据质量检测

10例患者癌组织及癌旁组织标本的CNV均检测成功，SNP-QC≥15.0、MAPD≤0.25及Waviness-SD≤0.12(图2)。

图2 ChAS软件分析样本质量

二、10例子宫内膜癌患者癌组织与癌旁组织样本CNV分析

10例癌组织标本中，经过ChAS软件分析，有6例检测到了CNVs，其中5例患者癌组织标本仅检测到重复或嵌合重复，例如：8号患者癌组织标本中1号染色体长臂存在重复，8号染色体存在嵌合重复(图3)，1例患者中既检测到了重复或嵌合重复也检测到了缺失及嵌合缺失。在10例癌旁组织中均未检测到100 Kb以上CNVs(表1)。

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蓝色框表示1号染色体长臂存在重复；红色箭头所指为8号染色体存在嵌合重复。图3 ChAS软件分析8号患者癌组织中的CNVs

在癌组织中，CNVs范围为10～146 Mb，平均为(75.35±40.00) Mb，分布在1、4、6、8、10、13、14、16、17、19、22号染色体上，其中，1q21.1q44 dup 103 Mb及8p23.3q24.3 dup 146 Mb出现了2次；在6例患者的癌组织标本中共检测到20种CNVs，缺失及嵌合缺失有9种，重复及嵌合重复有11种；Decipher及ClinVar数据库分析这些CNVs的致病性，结果表明有9种CNYs是致病的，其余11种为可能致病(表2)。

表1 10例子宫内膜癌患者癌组织与癌旁组织的CNVs检出情况

表2 子宫内膜癌组织CNV类型及致病性

讨 论

本研究对10例子宫内膜癌患者的癌组织及癌旁组织标本进行了CNV检测分析。有6例癌组织标本检测到了CNVs，检出率为60%，其中，除1例癌组织标本仅检测到1种CNV外，其他5例均检测到2种以上CNVs。10例癌旁组织均未检测到CNVs。本研究的癌症组织样本中共发现20种CNVs，主要集中在8号和10号染色体上，分别占20%(4/20)与25%(5/20)，其中，1q21.1q44 dup 103 Mb与8p23.3q24.3 dup 146 Mb比例较高，均出现2次。

我们对本研究中发现的20种 CNVs进行了致病性分析，发现其中11种为可能致病性变异，9种为致病性变异。Decipher及ClinVar数据库中已经报道的与这些CNVs片段长度相似的临床表型多为一些综合征表型，包括耳廓异常、先天性小头畸形、睑裂下垂、嘴角下倾等特殊面容；肾上腺发育不全、异位肛门、婴儿进食困难及先天性心脏病、全面发育迟缓等。但是关于这些CNVs与子宫内膜癌的发生发展及治疗预后情况却未见相关收录信息。

2011年，Karageorgi等[6]研究发现：谷胱甘肽巯基转移酶-T1(GST-T1)基因拷贝数变异可能会使子宫内膜癌的患病风险增加。2013年，Nature杂志报道称：子宫内膜癌的特色基因包括低拷贝数基因和高拷贝数基因，它们可能会影响子宫内膜癌患者的术后辅助治疗，可根据子宫内膜癌的基因组特征对其进行重新分类；并且建议临床医师对存在有CNVs的子宫内膜癌患者应考虑使用化疗而不是辅助放疗[4]。Moir-Meyer等[7]发现子宫内膜癌组织中存在罕见的种系缺失CNVs，这些CNVs分布于功能基因、CpG岛与sno/miRNAs区域，并对这些区域进行破坏，例如：病例组与对照组的sno/miRNA区域被这种罕见CNVs缺失造成的破坏比例高达30∶1。如果被罕见CNVs缺失破坏的区域还包括DNA修复基因，则可导致DNA修复基因调节异常而发生肿瘤[7]。当然，个别基因的缺失及失活也与子宫内膜癌的发生及预后相关，如ZFHX3基因失活或缺失不仅会影响子宫内膜癌的发生，还会影响患者的预后[8]。

子宫内膜癌组织的CNVs存在种族差异，有研究发现，尼格罗人携带高CNVs的比例显著高于高加索人(P<0.05)，与携带高CNVs的高加索人比较，携带高CNVs的尼格罗人的子宫内膜癌的无进展生存率较差[9]。因此，通过对子宫内膜癌组织CNVs数据的深入探索及综合分析，可以获取更多相关的生物学信息，从而更好地了解其进展规律及恶化机制，为今后子宫内膜癌的防治及个体化治疗打下基础[10]。但目前国内外关于这方面的研究报道较少。

本研究的10例子宫内膜癌样本中，有6例样本检出了CNVs，分布在1、4、6、8、10、13、14、16、17、19、22号染色体上，主要集中在8号和10号染色体。共发现20种CNVs，其中重复及嵌合重复有11种，占55%，缺失及嵌合缺失有9种，占45%，这说明子宫内膜癌的细胞分子特性存在一定异质性，并不是所有癌细胞均存在CNVs，这与以外文献报道一致[11-14]。分子诊断可以对组织病理学进行补充，为一些疑难病例提供更精确的诊断，但应用到临床实践中的仍然较少[15]。在今后的子宫内膜癌的治疗中，是否可以根据癌组织的CNVs及嵌合情况来对患者进行更加精准的治疗，还需进一步研究。

本研究仅分析了10例子宫内膜癌患者的癌组织与癌旁组织的CNVs情况，由于标本量有限，尚不能完全说明子宫内膜癌组织的CNVs对该疾病治疗及预后的价值。虽然有一定缺陷，但本研究发现这些CNVs主要集中在8号和10号染色体上，这可能对今后子宫内膜癌的个体化治疗有一定的意义。今后我们将继续扩大样本量进行研究，并随访患者生存及预后情况，以揭示检测子宫内膜癌组织CNVs对患者进行精准治疗的价值。