川桑中桑皮素的提取工艺优化

左亚奇 高志红 庞 策 孙转友 李 芳 甄 攀

1.河北北方学院，张家口，075000，中国

2.广宗县中医医院，邢台，054600，中国

3.北京中医药大学东方学院，廊坊，065000，中国

桑属植物分为35 个品种和10 个变种，我国发现的有15 个品种和4个变种［1］。桑属植物的药用价值很高，历代本草及医药典籍对桑属药材都有记录，常用于治疗咳嗽、水肿、风痹等症。川桑（Morus notabilis Schneid）是桑属植物中的一种，又名毛脉桑、圆叶桑，分布在我国四川和云南等地［2］。课题组前期研究证实［3］川桑中桑皮素（Mulberrin）含量较高，最佳提取溶剂为乙醇。桑皮素具有广泛的生物活性，如降血糖［4-5］、降血脂［6］、降血压［7］、抗肿瘤［8-9］、抗氧化［10］、抗炎［11］等。

本研究以桑皮素含量为指标，利用4 因素3 水平L9（34）正交试验，分析乙醇浓度、提取时间、溶媒倍数（提取溶剂体积与药材质量之比）、提取次数对桑皮素提取效率的影响，探讨川桑中桑皮素的最优提取工艺。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

Agilent 1 100 HPLC，美 国Agilent 公 司；YMCPack ODS-A 色谱柱，日本YMC 公司；HP HPLC 3D 化学工作站，UV 检测器。

川桑枝：采集于云南省金平县，经中国医学科学院药物研究所马林副研究员鉴定为川桑Morus notabilis Schneid。

桑皮素对照品：自制，从川桑中提取。乙醇，分析纯；甲醇，色谱纯。

1.2 实验方法

1.2.1 桑皮素含量测定方法的建立

1.2.1.1 对照品溶液的制备 桑皮素对照品的制备：川桑枝干燥，粉碎，过20 目筛，称取约2.0 kg，95%乙醇浸泡，提取、过滤、减压浓缩等，得浸膏。浸膏经硅胶、D101 大孔树脂、C18 等柱色谱分离，最后经色谱仪纯化得到桑皮素纯品。NMR 鉴定桑皮素结构，HPLC 检测纯度≥98%。

精密称取桑皮素对照品适量，乙醇溶解，制备500 μg·mL-1的桑皮素对照品溶液。

色谱条件：Agilent 1 100 液相色谱仪，YMC-Pack ODS-A 色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇-水（80∶20）；检测波长268 nm；柱温25 ℃；流速1.0 mL·min-1；进样量20 μL。桑皮素对照品色谱图（Fig.1）。

1.2.1.2 标准曲线的建立 利用倍比法对500 μg·mL-1的桑皮素对照品溶液进行稀释，得到不同浓度的对照品溶液，依次进样测定。以峰面积（y）为纵坐标，桑皮素浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，回归方程为y=140.5x+632.9，相关系数r=0.999 8，线性范围为3.906～250.0 μg·mL-1。

1.2.1.3 提取液的制备 川桑枝干燥，粉碎，过60 目筛，称取约2.0 g，精密称定。按照L9（34）正交试验表（Tab.1）进行提取，提取前均以提取溶剂浸泡3 h，提取液定容为50.00 mL。

Fig.1 HPLC chromatogram of Mulberrin reference substance 1-Mulberrin

1.2.1.4 桑皮素稳定性考察

1.2.1.4.1 放置时间对桑皮素稳定性影响 桑皮素提取液在室温下放置10 d，每天测定桑皮素含量，RSD 为3.3%，表明室温下10 d 内桑皮素稳定性良好。

1.2.1.4.2 温度对桑皮素稳定性影响 提取液分别水浴加热至24、30、40、50、60、70、80、96 ℃，并保持10 min，冷却后分别测定桑皮素含量，相对标准差（relative standard deviation，RSD）为3.7%，表明小于100 ℃时，温度对桑皮素稳定性无显著影响。

1.2.2 桑皮素提取工艺优化

采用L9（34）正交设计试验研究桑皮素提取工艺，设置乙醇浓度、提取时间、溶媒倍数（提取溶剂体积与药材质量之比）、提取次数4 个因素，每个因素均设置3 个水平。平行测定3 次，以3 次测定的桑皮素总和计量。

1.2.3 验证试验

取2 g 粉碎后的川桑，精密称定，按本文建立的最优提取工艺进行提取。

2 结果

2.1 桑皮素的计量测定

正交试验结果显示，川桑中桑皮素的最优提取工艺为A3B3C3D1，即20 倍95%乙醇回流提取3 次，每次提取0.5 h，提取前用提取溶剂浸泡3 h。从极差R 分析，因素A 和C 即乙醇浓度和溶媒倍数对提取效率的影响较为敏感，因素B 即提取时间的影响不显著。影响桑皮素提取率的顺序为溶媒倍数＞乙醇浓度＞提取次数＞提取时间。因素和水平（Tab.1），正交试验结果（Tab.2）。

2.2 桑皮素含量的测定

通过HPLC 法检测桑皮素含量，结果显示最优条件下提取所得桑皮素含量为1.510 mg·g-1，（Tab.3）。川桑提取液色谱图（Fig.2）。

Tab.1 Factor level table

Tab.2 Orthogonal test results of L9（34）

Tab.3 Content of Mulberrin

Fig.2 HPLC chromatogram of Morus notabilis extract 1-Mulberrin

3 讨论

3.1 正交试验结果显示川桑中桑皮素最优提取工艺为：20 倍95%乙醇回流提取3 次，每次提取0.5 h，提取前提取溶剂浸泡3.0 h。极差显示，影响桑皮素提取效率的顺序为溶媒倍数＞乙醇浓度＞提取次数＞提取时间。

3.2 桑皮素具有广泛的生物学活性，降血糖及抗肿瘤效果显著。我们前期研究证实，桑皮素对人食管鳞癌ECA109 细胞和人前列腺癌Du145 细胞的增殖有较强的抑制作用。最优条件下提取所得桑皮素含量为1.510 mg·g-1，本课题组前期测得［3］同一份川桑样品中桑皮素含量为1.070 mg·g-1，表明优化后的提取工艺确实提高了桑皮素的提取效率，有较高的实用价值。