基于网络药理学探讨人参有效成分对骨关节炎的保护作用机制研究

钟伟权 刘佑波 周才杰 郑银驹 邬明利 梁 敏 张媛媛

1.深圳市龙岗区第五人民医院药剂科，深圳，518111，中国

2.北京中医药大学深圳医院，深圳，518111，中国

3.深圳市龙岗区第五人民医院中医骨科，深圳，518111，中国

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的慢性退行性骨关节的病变，该病变病程发展缓慢，伴随时间的延长呈现进行性病理学加重。晚期OA 患者可能因为软骨等组织严重损伤而导致活动和生活能力的丧失［1］。既往研究共同证实OA 是由于机械负重以及某些生物化学因素的影响，导致骨关节软骨基质、软骨细胞和软骨下骨的代谢失衡，其中炎症细胞因子、氧化应激、骨关节机械力学等因素在OA 中扮演重要作用［2-3］。约80%的OA 患者存在难以自行缓解的疼痛和一定程度的运动受限。因此，通过有效药物治疗OA 显得尤为迫切。

人参是五加科植物人参的干燥根，具有对多种疾病防治的效果，主要生长在我国吉林省长白山等地区［4］。既往研究证实，人参有效成分人参多糖能够通过促进葡萄糖醛酸转移酶Ⅰ的表达，降低氧化应激反应进而改善大鼠OA［5］。人参皂苷Rb1 能够促进大鼠膝OA 软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白表达，抑制基质金属蛋白酶-13、Notch 表达，进而发挥保护OA 作用［6］。在IL-1β诱导的软骨细胞凋亡模型中，人参皂甙Rg1 能够降低细胞凋亡［7］。进一步研究发现，在入组30 例膝关节炎病例中，随机分组给予对应治疗后发现，人参皂甙Rg1 治疗组能够有效改善患者骨关节损伤，提高其生存治疗，改善膝OA 的临床症状［8］。以上研究均表明人参有效活性成分能够治疗OA，但是目前有关人参有效成分对治疗OA 具体分子机制以及整体药物与疾病的关系尚不清楚。网络药理学是基于整体构想，通过构建多层次的复杂网络，发现关键节点即关键靶基因并以此对疾病的发病机制和药物干预作用机制进行有效预测［9］。因此，本研究拟通过网络药理学从整体性角度探究人参有效成分治疗OA 的分子作用机制，为研究人参治疗OA 提供临床试验参考依据。

1 材料与方法

1.1 人参有效活性化合物及基因靶点筛选

通过中药系统药理学数据库（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及中药综合数据库（TCMID，http//megabionet.org/tcmid/）并按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 的标准筛选出人参的有效活性化合物。之后对筛选得到的化合物进行药物基因靶点的筛选。

1.2 骨关节炎相关基因靶点筛选

利 用GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）和OMIM 数据库（https：//omim.org/）筛选得到骨关节炎相关的基因靶点。

1.3 人参有效化合物基因靶点和骨关节炎基因靶点的交集筛选

采用R 语言软件包，应用VennDiagram 程序包，对人参活性化合物有效基因靶点和骨关节炎相关基因靶点的筛选结果进行取交集处理。得到能够预测人参有效活性化合物治疗骨关节炎的相关基因和蛋白作用靶点。

1.4 人参治疗骨关节炎基因调控网络的构建

利用Cytoscape（https：//cytoscape.org/）软件，导入人参的有效活性成分及筛选的药物基因靶点和疾病基因靶点的交集基因和蛋白，构建基因调控网络，采用力导向算法让节点的分布更加合理，得到更佳的视觉效果。采用string 在线工具（https：//string-db.org/）中的Multiple proteins 功能构建蛋白相互作用网络（protein protein interaction network，PPI network），根据连接基因的数量筛选出PPI 中的核心基因。

1.5 GO 富集分析

采用R 语言软件包，应用String 和Colorspace 程序包，对调控网络的基因进行GO 功能富集分析，并画出富集分析的柱状图及气泡图。使用模糊聚类算法，以注释共同度为基础对基因进行聚类计算，得出聚类分值，分值同代表的基因在基因列表中重要性成正比。

1.6 KEGG 通路分析

根据GO 富集分析结果，采用R 语言软件包，应用bioconductor 程序包，进行KEGG 通路分析，得到人参治疗骨关节炎的主要信号通路。采用超几何分布设计进行富集分析，富集分析的显著性按照Benjamini-Hochberg 校正法进行计算。

2 结果

2.1 人参有效活性化合物及靶点的筛选

按照OB≥30%和 DL≥0.18 的标准筛选出人参的有效活性化合物22 种，包括Diop，Stigmasterol，betasitosterol，Inermin，kaempferol，Chrysanthemaxanthin，Aposiopolamine，Celabenzine，Deoxyharringtonine，Dianthramine，arachidonate，Frutinone A，ginsenoside rh2，Ginsenoside-Rh4_qt，Girinimbin，Gomisin B，malkangunin，Panaxadiol，suchilactone，alexandrin_qt，ginsenoside Rg5_qt，Fumarine，其分子量、OB 及DL 如Tab.1 所示。根据人参的有效活性化合物筛选的药效靶点有90 个。

2.2 骨关节炎相关靶点的筛选

GeneCards 数据库筛选到骨关节炎相关2 856 个基因靶点，采用OMIM 数据库筛选得到骨关节炎相关155 个基因靶点，共计3 011 个基因靶点，按相关得分前20 的基因靶点如Tab.2 所示。

2.3 药物靶点和疾病靶点的交集筛选

进一步对90 个人参的药效基因靶点、3 011 个骨关节炎的疾病靶点进行取交集处理，得到51 种（ADRB2，PGR，NCOA1，PTGS1，PTGS2，PLAU，SLC6A4，OPRM1，BCL2，BAX 等）可能与人参治疗骨关节炎相关的基因作用靶点，如Fig.1 所示。

2.4 人参调控骨关节炎相关基因网络的构建

通过采用cytoscape 成功构建人参治疗骨关节炎的基因调控网络图（Fig.2），涉及到16 种化合物及51个靶点基因。并且采用string 工具得到人参治疗骨关节炎的PPI 图（Fig.3），节点表示蛋白质，蛋白之间的关联采用边表示，总共涉及51 个节点，73 条边，平均节点度为2.86。节点大小及颜色深浅与Degree 值密切相关，随着节点增大，由绿变红所代表的Degree 值也随之升高。边的粗细程度则代表Combine score，随着边的由细变粗，Combine score 值也随之变大。根据连接蛋白的数量筛选出PPI 中的核心蛋白包括JUN、RELA、CASP8、MAPK8、AKT1、IL1B、NCOA1、CASP3、BCL2、CASP9 等39 个（Fig.4）。

2.5 GO 富集分析

GO 富集分析为特定功能层次上由基因或蛋白数目构成的有向无环图，其中包括分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC）及生物过程（biological process，BP）3 个方面。结果显示基因功能主要富集在细胞核受体活性、转化因子活性及细胞因子受体结合等，如Fig.5 所示。

Tab.1 Effective active compounds of ginseng

Tab.2 Screening of targets related to osteoarthritis

Fig.1 Intersection screening diagram of drug targets and disease targets

Fig.2 Gene regulation network diagram of ginseng in the treatment of osteoarthritis

Fig.3 The protein-protein interaction network diagram （PPI）of osteoarthritis

Fig.4 Key target proteins in the PPI network

Fig.5 Histogram of GO enrichment analysis of key target genes

2.6 KEGG 通路分析

通过采用R 语言对筛选得到的51 个靶基因进行KEGG 信号通路富集分析。结果显示共有124 条信号通路。KEGG 通路主要富集在AGE-RAGE 信号通路（MCP-1，IL-1β，IL-6，IL-8，CASP3，MMP-2 等22 个基因）、IL-17 信号通路（IL-17，IL-6，TNF-α，MMP-13，MMP-9，MMP-3，MMP-1 等17 个基因）等信号通路，结果如Fig.6 所示。

3 讨论

中药人参属于植物人参干燥的根，是一种名贵的五加科人参药材。中医临床表明人参具有补脾益肺、大补元气等功效。由于人参具有复杂的化学成分，具有广泛的药理学活性，在临床上能够有效的防治多种疾病。糖类、皂苷类以及挥发性化合物是人参的主要活性成分［10-11］。既往研究证实，人参皂苷可通过降低炎症反应和基质金属蛋白等表达，进而改善OA 患者的临床症状［12］。然而，有关于人参有效活性成分对OA 的整体网络机制尚不完全清楚。本研究首先通过TCMSP数据库筛选得到22 种有效活性化合物，主要有包括人参皂苷、人参二醇、β-谷固醇等。众多研究均表明，人参有效活性化合物人参皂苷可以有效改善OA 患者的临床症状。主要有90 个药物基因靶点。GeneCards 和OMIM 数据库筛选OA 相关基因靶点共3 011 个。进一步，我们通过对药物基因靶点和疾病相关基因靶点交集筛选共得到51 个靶基因。分别为：ADRB2，PGR，NCOA1，PTGS1，PTGS2，PLAU，SLC6A4，OPRM1，BCL2，BAX，CASP9，JUN，CASP3，CASP8，PRKCA，PON1，HTR3A，AR，PPARG，F7，RELA，IKBKB，AKT1，TNFSF15，MAPK8，MMP1，STAT1，HMOX1，CYP3A4，CYP1A1，ICAM1，SELE，VCAM1，CYP1B1，ALOX5，HAS2，GSTP1，AHR，NR1I3，DIO1，PPP3CA，G S T M 1，S L P I，N F K B I A，I L 1 B C A S P 1，I F N G，MAP2K4，NR3C1，OPRD1，KDR。

Fig.6 KEGG enrichment analysis histogram of key target genes

为进一步明确人参活性成分和OA 之间的基因网络调控，通过cytoscape 成功构建人参治疗骨关节炎的基因调控网络图，共涉及16 种有效活性化合物和51 个基因靶点。String 工具筛选得到核心蛋白包括JUN、RELA、CASP8、MAPK8、AKT1、IL1B、NCOA1、CASP3、BCL2、CASP9 等39 个。39 个核心靶基因大致可归为炎症相关蛋白、凋亡相关蛋白和其他相关蛋白。既往研究证实，人参皂苷Rg1 可以通过上调p-Akt，升高B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）/Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl2-Associated X Protein，Bax），抑制活性caspase-3 表达，进而降低大鼠关节软骨细胞凋亡［13］。在糖尿病肾病大鼠模型中，人参皂苷Rg1 大鼠灌胃处理可以通过降低大鼠血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β等炎症因子含量，改善糖尿病肾病大鼠进程［14］。另外，在Aβ诱导的神经细胞毒性模型中，人参皂苷Rf 可以抑制caspase-1，IFN-γ活性，增加IL-13 活性，进而改善神经细胞损伤状况［15］。以上研究表明，人参有效成分可能通过调控细胞凋亡，炎症途径等改善OA。

GO 功能主要富集在细胞核受体活性、转化因子活性以及细胞因子受体结合等。KEGG 通路主要富集在AGE-RAGE、IL-17 和TNF 等信号通路。以往研究在类风湿关节炎患者中，外周血清中IL-17、TNF-α、IL-6 等含量显著升高［16］。进一步研究发现，通过给予人参皂苷处理可以有效降低OA 患者外周血中炎症细胞因子IL-17、IL-6 和TNF-α的含量，改善OA 的临床症状［17］。本研究基于网络药理学从生物网络平衡的整体观角度联系药物同机体的相互作用，通过生物学网络中节点的连接和关系来分析网络特性，进一步阐明药物作用机制，通过网络药理学分析，可以预测和分析药物作用的新靶点。人参治疗骨关节炎的主要药效靶点基因和作用机制还需进行深入的实验研究验证。另外本研究预测结果提示人参在动脉粥样硬化、非小细胞肺癌、乳腺癌等治疗中有潜在的应用价值，能够为人参的未来研究方向提供有力的参考依据。