五倍子分离组分抑制无乳链球菌的热动力学研究

郑梦珍，佟延南，翟少伟，林 茂，江兴龙，赖晓健，李忠琴

( 1.集美大学 水产学院，福建 厦门 361021； 2.鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021；3.厦门市渔用药物工程技术研究中心，福建 厦门 361021； 4.海南省海洋与渔业科学院，海南 海口 570206 )

在各类病害中，细菌性疾病仍是主要的问题，其中无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)不仅感染多种养殖鱼类，如尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、斑马鱼(Brachydaniorerio)等[1-2]，而且还能感染人类和哺乳动物[3-4]，造成极大的经济损失。抗生素等化学药物虽是细菌性疾病的主要防治手段，但长期使用会出现致病菌耐药性增强、药物残留、环境污染等问题，这使得人们不断寻求更加安全绿色的防治手段。我国中草药储备非常丰富，其中许多种类具有毒副作用小、抗病毒、抑菌、纯天然等优点，在治疗疾病中有显著的疗效，拥有广阔的开发前景[5]。

五倍子(GallaChinensis)是瘿绵蚜科，蚜虫刺伤漆树科，漆树属盐肤木的叶或叶柄而形成的囊状虫瘿。五倍子主要有效组分为鞣质、没食子酸等。其中鞣质是五倍子的主要组分，含量可达70%[6]。研究表明，五倍子具有抗菌、抗寄生虫、抗氧化、止泻等生物活性[7-10]。五倍子是水产养殖中用于防治细菌性疾病的重要药材。Wu等[11-12]研究表明，五倍子对副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、迟钝爱德华菌(Edwardsiellatarda)和嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)的生长均有明显抑制作用。中草药的成分复杂，在渔业病害防治工作中很难做到高效利用，因此，在开发新型高效的渔用药物过程中，对中药的活性物质进行分离和药效分析必不可少。

本试验采用高速逆流色谱法，从五倍子粗提物中分析及分离出五倍子活性组分[13]，分离五倍子的溶剂体系通过检测器时，其不同极性的组分会产生不同大小的信号，进而分离制备。笔者采用根据生物热动力学参数和热谱图比较分析药物药效作用的微量热法[14]，测定五倍子粗提物和各分离组分对无乳链球菌的体外抑制效果，表现为随时间变化所放出的全部热量，根据五倍子各组分对无乳链球菌的半数抑制质量浓度，筛选出具有较好抑制作用的五倍子组分，在制药过程中去除五倍子无效组分，提高药效，降低用药量，为渔用中药制剂在水产养殖中的开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

五倍子，购于福建铭远制药有限公司。

无乳链球菌(TN3L)为本实验室分离鉴定保藏菌株。

1.2 仪器与试剂

无水乙醇(西陇科学股份有限公司)、乙酸乙酯(西陇科学股份有限公司)、二甲基亚砜(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)、脑—心浸出液肉汤(广东环凯微生物科技公司)、琼脂粉(广东环凯微生物科技公司)。

大容量高速冷冻离心机(北京昊诺斯科技有限公司，RC-6 Plus型)、超声波粉碎仪(南京先欧仪器制造有限公司，X0DL-1000N)、多样品平行蒸发仪(瑞士BUCHI，旋转蒸发仪R-215)、分析型高速逆流色谱(上海同田生化技术有限公司，TBE-20A)、制备型高速逆流色谱(上海同田生化技术有限公司，TBE-300B)、离心浓缩仪(Labconco CentriVap，美国)、灭菌锅(AUTOCLAVE，美国，G154DS型)、酶标仪(Thermo Scientific，美国，1510-00669C)、生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司， LRH-250)、微量热仪(Waters LC，美国，TAMⅢ)。

1.3 试验方法

1.3.1 制备五倍子粗提物

精确称取五倍子药粉(粒径约150 μm)，以料液比1∶5与70%乙醇进行混合，浸泡30 min后，在超声破碎仪下提取30 min，重复提取2次后，于大容量高速冷冻离心机中3000 r/min离心20 min，取上清液用旋转蒸发仪在70 ℃条件下蒸发获得浸膏。将所得浸膏烘干后研磨，得到五倍子醇提物药粉，4 ℃保存备用。

1.3.2 高速逆流色谱仪分析和分离提取五倍子粗提物各组分

通过五倍子组分的结构性质和溶剂极性大小确定溶剂最佳分离体系为：乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，体积比)，可分离5个峰[15]。使用分析型高速逆流色谱仪(HSCCC)(TBE-20A)测试并验证试验条件，记录并根据公式计算固定相保留率：

固定相保留率/%=(V1-V2)/V1×100%

式中，V1为色谱柱线圈体积，V2为固定相被推出的体积。

利用分析型高速逆流色谱的试验条件，将已确定的溶剂体系在制备型高速逆流色谱上进行放大，分离提取出五倍子的不同组分。将收集分离提取物蒸发干燥后保存备用。

1.3.3 微量量热法测定五倍子对无乳链球菌TN3L的生物活性

使用TAMⅢ六通道微量热仪测定五倍子各组分及其粗提物对无乳链球菌的体外抑制作用。精确称取制备的五倍子醇提物及分离的5个组分药粉，选用1 mL 5% 二甲基亚砜作为溶剂对其进行溶解。将6管已经过高压灭菌的安瓿瓶进行编号，在无菌条件下，向各安瓿瓶中分别加入液体培养基2.25 mL，并接种107cfu/mL的菌液100 μL；在编号为2～5的安瓿瓶中加入不同体积的药液以制成具有浓度梯度的处理组，编号1和编号6安瓿瓶分别设置为空白对照组和溶剂对照组，结束操作后密封。提前设置仪器工作温度为28 ℃，后按编号将安瓿瓶分别放入微量量热仪的6个通道中，记录试验，得到关于细菌生长代谢的热功率随时间变化的关系(P-t)曲线。

1.3.4 细菌生长代谢受药物作用影响下的热动力学研究

微生物的指数生长期中产热功率(Pt)与速率常数(k)之间存在如下关系式[16]：

Pt=P0exp(kt)或lnPt=lnP0+kt

式中，P0为细菌指数生长期起始点的热功率，t为指数生长期中某一对应的t时刻。

在热谱曲线上，取指数生长期的一段Pt与t的数值，代入上述公式中，并运用Matlab进行计算，得到k值，再与药物含量(c)拟合成k与c的曲线方程。

为定量描述各组分对细菌的抑制效果，通常定义抑制率I如下：

I=(k0-kc)/k0×100%

式中，k0为空白组安瓿瓶中菌株生长速率常数，kc为药物含量为c时菌的生长速率常数。

一定含量下，抑制率值越大，表明抑菌能力越强，当抑制率为50%时，对应的药物含量为半数抑制质量浓度(IC50)。

2 结果与分析

2.1 高速逆流色谱分离制备五倍子各组分

分析型高速逆流色谱研究五倍子组分的分离体系，得到分析图谱(图1)，图中有5个明显的峰，体系乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，体积比)的分离效果良好，固定相保留率约为36%，满足逆流色谱的分离要求。

依据分析型高速逆流色谱的试验条件，将确定溶剂体系按比例扩大，在制备型高速逆流色谱上进行分离，图谱见图2，详细的分离结果见表1。该体系溶剂在制备型高速逆流色谱上也可以分离得到5个峰(W1～W5)。W2、W3、W53个组分总含量为90.4%，是五倍子的主要组分。

图2 制备型高速逆流色谱分离五倍子图谱Fig.2 Chromatogram of Galla Chinensis separated by preparative HSCCC

表1 制备型高速逆流色谱分离五倍子各组分的分析结果Tab.1 Components in Galla Chinensis separated by preparative HSCCC

2.2 五倍子分离组分对无乳链球菌TN3L的生物活性测定

无乳链球菌TN3L在不同质量浓度五倍子粗提物及各分离组分作用下的微量热生长代谢热谱曲线见图3，从各热谱图中正常代谢曲线1可以看出，无乳链球菌TN3L的生长阶段分别为延滞期、指数生长期、稳定期和衰减期。1号空白对照组与6号溶剂对照组的菌株生长曲线差异不大，可知用于溶解五倍子的5%二甲基亚砜对无乳链球菌生长过程的影响不大，因此影响菌株生长的因素只有药物浓度的大小。2～5号曲线为加入不同质量浓度药液的生长曲线，除组分W1外，均表现出一定的差异性，曲线的指数生长期出现越晚，Pt峰值越低，表明细菌的生长活力越低，药物对细菌的抑制效果越佳。取图中的各曲线指数生长期的Pt-t数据，按照1.3.4的计算方法，得出药液质量浓度与无乳链球菌TN3L生长速率k的拟合方程和半数抑制质量浓度(表2)。由图3b可见，2～5曲线与1、6曲线基本重叠，且不能计算出半数抑制质量浓度，故五倍子组分W1对无乳链球菌TN3L没有抑制效果。根据计算出的半数抑制质量浓度，得出其他组分与粗提物的抑菌强度依次为W2

图3 无乳链球菌TN3L在五倍子的各分离组分作用下，测得在不同质量浓度药液下的生长代谢热谱曲线Fig.3 The Power-Time curves of TN3L growth in the presence of the components from Galla Chinensis at various concentrations

表2 五倍子粗提物及各分离组分质量浓度(c)与无乳链球菌TN3L生长速率(k)的拟合方程及半数抑制质量浓度Tab.2 The relationship between the concentrations of the components separated from Galla Chinensis and growth rate constant of TN3L, and the half inhibitory concentrations.

3 讨 论

本试验采用生物热动力学的方法初步探讨五倍子粗提物及其分离组分对无乳链球菌TN3L的抑菌效果，筛选出具有较好抑制作用的五倍子分离组分，为渔用中药制剂在水产养殖中的开发应用提供科学依据。五倍子的主要有效成分为鞣质，含量约70%，其在酸性条件下可水解为没食子酸[6]。没食子酸具有较好的抑菌活性，可溶于水、乙醇等溶剂中，没食子酸在乙醇中的提取率显著高于水提取[17]。靳恒[18]采用高速逆流色谱法在乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，体积比)等4个溶剂体系下提取五倍子的组分，发现分离体系乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，体积比)相较于其他3个体系，分离效果最好且最稳定。本试验在乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，体积比)的溶剂分离体系下，固定相的保留率为36%，体系稳定，符合试验要求，作为分离五倍子组分的溶剂体系进行制备的效果良好，W2、W3、W53个组分的含量较高，是五倍子的主要组分。在实际制备分离过程中，由于五倍子成分复杂，常常会遇到几个极性相似物质峰在一次分离中不能有效分开的现象，为达到最佳的分离效果，尚需不断寻求有效的辅助措施。试验从分析型高速逆流色谱转向制备型高速逆流色谱的过程中，受到温度、转速等工艺参数改变的影响，分离效果可能出现不同程度的降低，因此还需要进一步的优化工艺条件。

微量量热法是评价生物活性物质抑菌效果的一种先进、灵敏的方法，微生物在代谢过程中产生的热量，经过微量热仪的精密检测，获得热功率—时间曲线，这些曲线反映了微生物的生长阶段与模式、温度变化情况、药物的抑菌效果等。崔健等[19]使用微量量热法研究在不同产地、不同颜色拳参作用下大肠杆菌(Escherichiacoli)的生长代谢曲线，发现均有不同程度的抑制作用。通过微量量热法检测五倍子粗提物及其各分离组分对无乳链球菌TN3L的抑制作用，发现在同一分离组分水平上，药物含量越高，细菌的生长代谢热谱曲线越平缓，生长速率常数k值越低，即药物抑菌作用越强。在不同药物水平上，药物对菌株的半数抑制质量浓度越低，抑菌效果越好。五倍子粗提物及其各分离组分的半数抑制质量浓度大小依次为：粗提物

4 结 论

本试验通过高速逆流色谱法分离出五倍子5个组分，通过微量量热法检测五倍子粗提物及其各分离组分对无乳链球菌TN3L的抑制作用，发现在同一分离组分水平上，药物质量浓度越高，抑菌作用越强。在不同药物水平上，五倍子粗提物及其各分离组分的抑制作用依次为：粗提物>W5>W3>W4>W2。根据半数抑制质量浓度的结果，五倍子组分W3～W5均能显著抑制无乳链球菌TN3L的生长。结合制备型高速逆流色谱的结果，组分W3、W2、W5的含量最高，组分W4的含量仅为1.218%。因此，在配伍五倍子的实际应用中，可以适当剔除W1、W2和W4组分，保留W3和W5，达到减少用药量、有效地进行疾病防治、降低养殖成本的目的。