高效液相色谱法检测猪肉、羊肉中阿托品残留量的研究

薄永恒，李淑焕，杨修镇，陈 玲，魏茂莲，李有志*，章安源，侯云峰，张 勇

(1.山东省兽药质量检验所，山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南 250022；2.山东省农业工程学院食品科学与工程学院，济南 250100；3.山东金铸基药业有限公司，济南 271100)

阿托品(atropine)是一种M胆碱受体阻断药,具有解除平滑肌的痉挛、抑制腺体分泌、解除迷走神经对心脏的抑制、兴奋呼吸中枢等药理活性, 在临床医学上，阿托品主要用来解除平滑肌痉挛、缓解内脏绞痛、改善循环和抑制腺体分泌，并扩大瞳孔，升高眼压，兴奋呼吸中枢。而在兽医临床上主要作为解毒药,缓解有机磷中毒的症状[1]。

但近年来，不法商贩利用阿托品的以上药理特点，在长途运输前或宰前注射阿托品，利用其抑制腺体分泌的作用特点在短时间内引起动物口渴自主大量饮水，有效减少长途运输的损失、提高屠宰率和保持短时间内猪肉、羊肉的持水性能, 从而获得非法高额利润,己经成为业内公开的秘密[2-3]。若食用含有阿托品残留的动物性食品后，人会出现瞳孔扩大、神志模糊、狂躁不安、抽搐、昏迷等症状，因食用含有阿托品的猪肉、羊肉而产生的人群集体中毒事件在近30年来也在报纸和杂志上有报道。我国目前暂未制定阿托品在动物源性食品中相关残留限量，欧盟也仅仅对婴幼儿食品中阿托品残留设有1 ng/g 的最高残留限量标准[4-5]。

为了保障食品安全和公共卫生安全，必须加强对运输活猪、活羊屠宰后肉品中阿托品残留的监控，本文对猪肉、羊肉中阿托品残留量的检测方法进行研究，选择普及广且操作简单高效液相色谱仪进行检测，分别对试样前处理、色谱方法等条件摸索优化，保证了检测方法快速、准确，可以满足大批量样品高灵敏测定，为猪肉、羊肉的安全检测提供可靠的确证检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器 高效液相色谱仪(配紫外检测器)waters公司；MP200B天平；台式高速冷冻离心机(贝克曼公司)；氮吹仪(美国Organomation公司)；固相萃取装置；XW-80A涡旋混合器(上海精科实业有限公司)；HY-4调速多用振荡器。

1.2 试剂 阿托品对照品(纯度为99.9%,Dr.Ehrenstorfer公司)；甲醇、乙腈、正己烷为色谱纯(Fisher公司)；磷酸、三乙胺、氯化钠均为分析纯；实验用水均为超纯水。

1.3 标准溶液配制 标准储备液：精密称取阿托品对照品10 mg，用甲醇定容至100 mL，制成100 μg/mL的溶液，作为标准储备液，-20 ℃标箱保存,在3个月内使用。

1.4 实验方法[6]

1.4.1 色谱条件 色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm(i.d.),粒径5 μm；流动相为0.025 mol/L磷酸溶液(用三乙胺调PH=3)-乙腈(87+13，v/v)；流速1.0 mL /min；进样量20 μL；柱温30 ℃。

1.4.2 样品前处理

1.4.2.1 提取[7]称取均质的猪肉或羊肉组织 2.00 g(精确至0.01 g)置于50 mL具塞离心管中，加乙腈10 mL，涡旋震荡1 min，震荡提取15 min，8000 r/min离心5 min，吸取上清液。向残渣中加入乙腈10 mL，重复提取1次，合并2次提取液，氮吹至近干，用4%氯化钠溶液5 mL，加正己烷5 mL，涡旋1 min，静置分层，弃去正己烷溶液，重复除脂一次，取4%氯化钠溶液层，置于10 mL具塞离心管中，备用。

1.4.2.2 净化[1]取HLB固相萃取柱，依次使用3 mL甲醇、3 mL水依次活化，将备用液全部过柱，分别用水3 mL和5%甲醇溶液3 mL淋洗，抽干。用乙腈3 mL洗脱，洗脱液于50 ℃下氮气吹干。准确加入流动相1.00 mL，溶解定容，涡旋混匀，过0.22 μm微孔滤膜，进高效液相色谱仪测定。

1.4.3 标准曲线的绘制 分别精密量取标准储备液适量，用流动相稀释成浓度分别为：0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 μg/mL标准溶液，经 0.45 μm滤膜过滤后，用高效液相色谱检测，外标法定量。以阿托品峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.4.4 灵敏度 在空白猪肉、羊肉中添加阿托品标准溶液，分别制成0.25、0.5、1.0、5 mg/kg等4个浓度的空白添加样品，按确定的提取净化方法处理后，经高效液相色谱检测，观察阿托品色谱峰信噪比和对应的药物浓度，确定其检测限和定量限。

1.4.5 准确度与精密度 采用标准添加法，在猪肉、羊肉的匀浆组织中添加3个不同浓度的阿托品进行回收率试验。各浓度进行 5个样品平行试验,重复 3次，求批内、批间相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 标准曲线 阿托品浓度在0.5～20.0 μg /mL范围内，色谱峰面积有良好的线性关系，标准曲线见图1。

图1 阿托品溶液的标准曲线

2.2 方法灵敏度 按上述方法进行处理,猪肉、羊肉空白组织中添加浓度为0.25 mg /kg时，阿托品峰信噪比(S/N)均>3，确定为方法的检测限，添加浓度为 0.5 mg /kg时，信噪比(S/N)均>10，确定为方法的最低定量限。猪肉、羊肉空白组织中添加0.5 mg/kg阿托品及相应的空白组织的高效液相色谱图，见图2～图5。阿托品标准品色谱见图6。

图2 空白猪肉液相色谱图

图3 空白猪肉中添加阿托品液相色谱图(0.5 mg/kg)

图4 空白羊肉液相色谱图

图5 空白羊肉中添加阿托品液相色谱图(0.5 mg/kg)

图6 阿托品标准品(1.0 μg /mL)色谱图

2.3 方法准确度与精密度 空白组织中阿托品在0.5、1.0、5 mg/kg三个添加水平，平均回收率为80%～110%，批内相对标准偏差≤10 %, 批间相对标准偏差≤20 %。结果见表1。

表1 猪肉、羊肉中阿托品的相对回收率和精密度

3 讨论与结论

3.1 色谱条件的优化 在前期摸索条件的基础上优化了流动相条件。首先，甲醇+0.2 mol/L磷酸二氢钠(pH=3.5)=(45+55)[1],由于流动相盐较多，容易堵塞仪器通道及色谱柱，且柱压太高，弃用。其次，改为甲醇∶0.1%三乙胺(pH=5.8)=35∶65[8-9]，发现出峰时间为4 min左右，与文献不一致，且由于测定样品是肌肉组织，出峰时间早，容易出现分离度太小，目标物与杂质不易分离现象，弃用。最后改为，0.025 mol/L磷酸溶液(pH=3.0)∶乙腈=85∶15[6]，出峰时间在9 min左右，但是在做添加回收时，猪肉和羊肉中在8 min时有一高含量杂质与目标峰分离度小于1.5，最后调整流动相为0.025 mol/L磷酸溶液(pH=3.0)∶乙腈=87∶13，出峰时间在12 min左右，所有杂质与目标物均有效分离。其中用三乙胺调节pH值，三乙胺可有效提高峰形。

通过对阿托品标准溶液进行的紫外光谱扫描，发现在波长为210～202 nm区间有强吸收，而在多个参考文献中都是以210 nm作为测定波长，选择210和202两个波长进行了对比实验 实验结果表明，在本法所采用的流动相下，210 nm处的测定结果较好，故确定210 nm为检测波长。

色谱柱采用了C18柱，250 mm×4.6 mm(i.d.),粒径5 μm，柱子较长，对多杂质的分离效果较好。柱温在25～30 ℃时，对分离影响不大，条件定为室温，有利于节能。进样量20 μL，有利于降低检出限。

3.2 样品处理方法的优化

3.2.1 提取条件 本研究在李伟妮等研究基础上[1]，提取条件共优化了2次。第一次增加了冰箱-20 ℃冷冻时间为5 min，用于除脂肪；用水提取体积为10 mL提取2次，精简了实验步骤。但在净化时，出现过柱困难的情况，净化效率严重降低，原因在于超声后，细胞碎片过多，细小杂质更容易堵住HLB小柱，其次离心转速及时间不够，细胞碎片没有沉淀，也容易堵住HLB小柱。第二次提取优化，更换了提取条件，改为乙腈提取2次，正己烷除脂，减少了超声后细胞碎片的产生，同时脂肪有效去除[7]。用4 %氯化钠溶解氮吹后的残渣，能减少正己烷与水的乳化作用，使之更容易分层。经改进后的提取条件，提取彻底，杂质更少，脂肪颗粒减少，为后续净化步骤奠定了基础。

3.2.2 净化条件 净化条件改善了淋洗步骤，将丙酮淋洗，改为水和5 %的甲醇水淋洗。水和5 %甲醇的极性比较大，能将保留在小柱中的杂质大多数冲洗出来，为液相的分离效果以及保护液相色谱柱提供了保障。

3.3 结论 通过对样品的提取条件、净化条件、色谱条件的优化，最后设定阿托品在猪肉、羊肉中的检测限为0.25 mg/kg，定量限为0.5 mg/kg。本方法在0.5～5 mg/kg添加浓度范围内，阿托品回收率为80%～110%，符合兽药残留实验室质量控制规范[10]。该方法简单快速,灵敏度高,重现性好,适合猪肉、羊肉中阿托品残留的测定。