烯丙孕素对照品的研制及标定

姜淋洁，甄盼盼，崔志刚，杨雪，于小婷，程雪娇

(天津市中升挑战生物科技有限公司，天津 300080)

烯丙孕素(又称四烯雌酮，Altrenogest)，分子式为C21H26O2，CAS号：850-52-2，是一种合成的C21甾类孕激素，属于19-去甲睾丸素类[1-2]。烯丙孕素是一种人工合成的口服型促孕激素[3]，通过抑制促性腺激素分泌而调整母畜发情周期[4],最早于1984年在法国获得上市许可,在欧盟和美国被批准用于犬(母犬黄体不足[5])、马(母马同期发情[6]、孕酮水平不足的母马妊娠维持[7]、长期使用抑制赛马发情以保持其竞技状态[8-9]))和猪(母猪同期发情[10-11])。目前，欧美发达国家已将烯丙孕素作为养猪生产中必不可少的同期发情调控剂，且无更好的替代产品[12]。我国已经批准法国诗华动物保健公司和法国维克有限公司的烯丙孕素内服溶液在国内注册使用[13-14]，同时国内多家企业的烯丙孕素及口服液已作为二类新兽药进行注册申报并生产[15-17]。但是目前烯丙孕素对照品国内和国外并无单位提供，多为企业自制，给烯丙孕素原料及其口服液的质量控制带来了困难，因此本文进行了烯丙孕素工作对照品的研制并建立了标定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器 安捷伦1260 高效液相色谱仪包括包括G1311C四元泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G1315D DAD检测器，C.01.04[35]色谱工作站，美国安捷伦科技有限公司；安捷伦1260 II 高效液相色谱仪包括包括G7115A四元泵，G7129A自动进样器，G1316A柱温箱，G7111A DAD检测器，C.01.07 SR2[255]色谱工作站，美国安捷伦科技有限公司；ES225SM-DR电子天平，普利赛斯仪器有限公司；超声波清洗器，昆山仪器有限公司；真空泵，ASL仪器有限公司。

1.2 药品与试剂 烯丙孕素原料、烯丙孕素对照品原料均由天津市中升挑战生物科技有限公司中试制备；正己烷，色谱纯，西陇化工科技有限公司；异丙醇，色谱纯，西陇化工科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 采用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振波谱(NMR)对烯丙孕素对照品进行结构确认 测试方法及条件：UV 测定，供试品用甲醇溶解，浓度为0.014 mg/mL，扫描范围190～400 nm；IR 测定，采用KBr压片法，供试品与KBr的比例约为1∶200；1H-NMR测定为600 MHz，13C-NMR测定为600 MHz，供试品采用DMSO溶解；MS 测定，离子化方式为ESI+。

1.3.2 采用X射线单晶衍射法对烯丙孕素对照品原料进行结构确认 单晶培养条件：取烯丙孕素对照品原料0.5 g，置烧瓶内，加乙酸乙酯溶解，过滤，室温放置，缓慢挥发溶剂至晶体长成。

1.3.3 HPLC 纯度检查 参照中华人民共和国农业农村部公告第101号[16]附件3中烯丙孕素原料质量标准项下有关物质测定的色谱条件，采用ZORBAX CN C18柱(250 mm×4.0 mm, 5 μm)，流动相正己烷-异丙醇(98∶2)，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，检测波长235 nm。称取烯丙孕素对照品原料适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含1 mg的烯丙孕素溶液，作为供试品溶液。分别精密量取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图色谱图至主峰保留时间的2.5倍，按峰面积归一化法计算纯度。

1.3.4 干燥失重 按《中国兽药典》2015 年版一部[18]干燥失重测定法(附录0831)测定，分别精密称取两份烯丙孕素对照品原料1.00 g，在105 ℃干燥至恒重。

1.3.5 炽灼残渣 按《中国兽药典》2015年版一部[18]炽灼残渣测定法(附录0841)测定，分别精密称取两份烯丙孕素对照品原料1.00 g置已炽灼至恒重的坩埚中，缓缓炽灼至完全炭化，放冷；加硫酸0.5 mL使湿润，低温加热至硫酸蒸汽除尽后，在700～800 ℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷，精密称定后，再在700～800 ℃炽灼至恒重，即得。

1.3.6 烯丙孕素对照品原料熔点测定 按《中国兽药典》2015年版一部[18]熔点测定法(附录0841)第一法中传温液加热法测定，记录对照品原料初熔至全熔时的温度，重复测定3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 结构确证

2.1.1 采用UV、IR、MS、NMR对烯丙孕素对照品结构确认 结果如下：UV λmax：239 nm、343 nm；IR v：3370、3070、3017、2968, 2869、2931、1639、992、913 cm-1；ESI-MS m/z：311.2[M+H]+，与烯丙孕素理论分子量吻合；1H NMR(DMSO)：δ6.496(d，1H，J=10.2 Hz，C-11)，6.428(d，1H，J=10.2 Hz，C-12)，5.932(m，1H，C-21)，5.673(s，1H，C-4)，5.046(t，2H，C-22)，4.452-1.534(m，17H)，0.899(s，3H，C-18)；13C NMR(DMSO)：δ197.868(1C，C-3)，156.383(1C，C-5)，143.063(1C，C-12)，142.376(1C，C-7)，136.289(1C，C-3)，126.776(1C，C-6)，123.900(1C，C-11)，123.312(1C，C-4)，117.591(1C，C-22)，80.988，49.412，48.085，42.905，38.274，36.794，33.621，31.203，27.228，24.108，23.223，17.295(12C，C-17，C-13，C-14，C-20，C-8，C-2，C-16，C-10，C-9，C-1，C-15，C-18)。文献[22]报道数据为1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ6.47(dd，1H，J=10.5 Hz，Hfrom C-11)，6.36(dd，1H，J=10.5 Hz，Hfrom C-12)，5.98-5.96(m，1H，-CH2CH=CH2)，5.78(s，1H，Hfrom C-4),5.23-5.14(m，2H，-CH2CH=CH2),2.80-1.30(m，17H),1.03(s，3H，CH3)；13C NMR(125MHz，CDCl3)：δ199.4(1C，C-3),156.7(1C，C-5),142.2(1C，C-12),141.8(1C，C-10),134.3(1C，C-9),127.2(1C，C-4),124.1(1C，C-11),123.9(1C，-CH2CH =CH2),119.4(1C，-CH2CH=CH2),81.3(1C,C-17)，49.2，48.0，42.9，38.5，36.9，35.2，31.7，27.3，24.5，23.3(10C，C-1，C-2，C-6，C-7，C-8，C-13，C-14，C-15，C-16，-CH2CH=CH2)，16.1 (1C，-CH3)。烯丙孕素的结构式见图1，分子式为C21H26O2，理论分子量为310.43，上述结果表明烯丙孕素对照品原料化学结构与烯丙孕素相同。

图1 烯丙孕素结构式

2.1.2 采用X射线单晶衍射法对烯丙孕素对照品原料进行结构确认 结构单元见图2。

图2 烯丙孕素对照品原料结构单元

2.2 HPLC纯度检查 烯丙孕素对照品原料在两台安捷伦仪器上测得的纯度见表1，两台仪器取平均值，得到烯丙孕素对照品原料的纯度为99.96%，见图3和表1。

图3 烯丙孕素对照品原料纯度测定色谱图

表1 烯丙孕素对照品原料纯度测定结果

2.3 残留溶剂 本研究中烯丙孕素原料在中试生产中用到的溶剂有乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇和正己烷，且烯丙孕素对照品原料最后采用乙酸乙酯进行精制，通过干燥失重试验可知，对照品原料在105 ℃下能很快干燥至恒重，说明残留溶剂在该条件下能很快挥发除去，故残留溶剂的结果可不必单独测定。

2.4 干燥失重 测得两份对照品原料的干燥失重为0.021%和0.030%，取平均值为0.026%。表明烯丙孕素对照品原料在该温度下水分和残留溶剂能很快挥发出来，可用干燥失重结果代替水分和残留溶剂测定。

2.5 炽灼残渣 测得两份对照品原料的炽灼残渣为0.017%和0.015%，取平均值为0.016%。表明烯丙孕素对照品原料中的无机不挥发性杂质的含量为0.016%。

2.6 烯丙孕素对照品原料含量确定 烯丙孕素对照品定值采用国际通用的质量平衡法确定含量，同时定量核磁共振波谱法对质量平衡法赋值准确性进行验证。

2.6.1 质量平衡法 赋值结果含量(%)=纯度×(1-干燥失重-炽灼残渣)×100%，结果为99.96%×(1-0.026%-0.016%)=99.92%

2.6.2 定量NMR法验证结果 依据《中国药典》2015年版四部[20]通则0441核磁共振波谱法，以马来酸作为内标，样品用氘代二甲基亚砜溶解后，以烯丙孕素H谱中的5.94信号峰与内标物H谱中的6.28信号峰计算供试品的含量，定量NMR法含量测定结果为99.60%(图4)。

图4 烯丙孕素定量核磁共振光谱图

2.7 烯丙孕素工作对照品稳定性考察 烯丙孕素工作对照品，用安瓿瓶分装，50 mg/瓶，放入药品稳定性试验箱中，在(40±2)℃、相对湿度75%±5%条件下放置6个月，分别于第1、2、3、6 月取样，对样品性状、熔点、纯度进行检查。表2结果表明，烯丙孕素工作对照在(40±2)℃、相对湿度75%±5%条件下放置6个月稳定。

表2 稳定性考察结果

3 讨论与结论

3.1 烯丙孕素结构确证 烯丙孕素为C21甾类孕激素化合物，化学结构中具有手型碳原子，因此单纯采用核磁共振方法难以确定每个手型中心的绝对构型，本研究通过溶剂结晶方法培养得到烯丙孕素对照品原料单晶，采用X-射线单晶衍射方法对烯丙孕素的构型进行进一步确定。

3.2 质量平衡法赋值 本研究按质量平衡法对本批烯丙孕素对照品原料进行了含量定值[21]。根据质量平衡法原理，标准品含量(%)=[100%-水分(%)-残留溶剂(%)-无机杂质(%)]×纯度(%)，本公式中的水分和残留溶剂的测定结果可用干燥失重结果代替[22]。烯丙孕素对照品原料最后采用乙酸乙酯进行精制，乙酸乙酯沸点为76 ℃，在105 ℃能全部挥发出去，说明水分和有机溶剂能完全挥发，可用干燥失重结果代替水分和残留溶剂的测定。

3.3 含量定值 为了准确标定烯丙孕素对照品原料的含量，采用了两种不同原理的方法进行测定。按中华人民共和国农业农村部公告第101号[16]附件质量标准中烯丙孕素原料的有关物质测定方法测定对照品原料的纯度，结果表明质量平衡法结果与定量核磁波谱法结果相对偏差为0.25%，两种方法标定结果一致。

本批烯丙孕素对照品原料的结构鉴定结果与其结构式相符合，用质量平衡法测得的烯丙孕素对照品原料含量为99.92%，用定量核磁共振波谱法法测得的结果为99.60%，两种方法测定结果差异较小，说明本批烯丙孕素对照品原料赋值准确，可作为烯丙孕素原料及其制剂研制过程中对照品使用。