麻杏石甘口服液、杨树花口服液中非法添加黄芩苷HPLC-PDA检测方法的建立

龚旭昊，杨星，张璐，范强，汪霞

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

麻杏石甘口服液由石膏、麻黄、苦杏仁、甘草四味中药制备而成，具有清热、宣肺、平喘等功效，主治肺热咳喘[1]。杨树花口服液由杨树花药材制备而成，具有清热解毒、化湿止泻等功效，主治痢疾、肠炎[2]。两种口服液在临床上均有较好疗效而被广泛使用。黄芩苷是从黄芩药材中提取分离出的一种黄酮类化合物，具有显著的生理活性，可泻实火，除湿热，主治壮热烦渴、肺热咳喘、湿热泻痢等症[3]。由此可见，黄芩苷和以上两种口服液的在功效主治方面有较多相似之处。近来，在监督检验工作中，通过筛查发现某企业的一批麻杏石甘口服液样品中非法添加了处方外成分黄芩苷，但目前尚没有现行的标准和方法可用于该项检测。因此，参考《中国兽药典》2015年版二部黄芩药材质量标准及相关文献，选择黄芩苷为测试药物，麻杏石甘口服液和杨树花口服液为目标制剂，建立了麻杏石甘口服液和杨树花口服液中非法添加黄芩苷的检查方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪(Waters e2695，2998 PDA检测器，Empower3色谱工作站软件)，分析天平(Mettler XS205，十万分之一)，昆山KQ-300型超声波清洗器，Millipore超纯水仪。甲醇(德国Merck公司，色谱纯)，磷酸(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，超纯水(Millipore超纯水仪制备)。

1.2 试药 黄芩苷对照品(批号：Z0271705，中国兽医药品监察所，96.8%)；麻杏石甘口服液和杨树花口服液供试品空白：均为经检测合格的相关监督抽检样品；麻杏石甘口服液供试品：某企业生产的经检测含有黄芩苷非法添加的样品；杨树花口服液供试品：上述杨树花口服液供试品空白中添加黄芩苷测试药物(阳性模拟)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Shiseido MGⅡ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇-水-磷酸(V:V:V=45:55:0.2)，柱温：30 ℃，流速：1.0 mL/min，进样量：10 μL。二极管阵列检测器，采集波长范围为210～400 nm，分辨率为1.2 nm，记录278 nm波长处的色谱图。供试品溶液中黄芩苷色谱峰和相邻色谱峰的分离度应符合要求。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 称取黄芩苷对照品10 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为100 μg/mL的黄芩苷对照品溶液。按2.1方法测定，结果见图1。

图1 黄芩苷对照品溶液色谱图

2.2.2 空白溶液 取麻杏石甘口服液和杨树花口服液供试品空白各1 mL，分别置100 mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得两种供试品空白溶液。按2.1方法测定，结果见图2～图3，表明两种供试品基质对待测物黄芩苷没有干扰。

图2 麻杏石甘口服液空白溶液色谱图

图3 杨树花口服液空白溶液色谱图

2.2.3 供试品溶液 取麻杏石甘口服液供试品1 mL，照2.2.2项下操作制备成麻杏石甘口服液供试品溶液；取杨树花口服液供试品1 mL，置100 mL量瓶中，再称取10 mg黄芩苷对照品置同一量瓶中，加50%甲醇溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得杨树花口服液供试品溶液。结果见图4～图5。

图4 麻杏石甘口服液供试液色谱图

图5 杨树花口服液供试液(阳性模拟)色谱图

2.2.4 建立光谱数据库的溶液 以黄芩苷对照品溶液作为建立光谱数据库的溶液。

2.3 峰纯度与光谱相似度检查 取两种供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按2.1色谱条件测定。对两种供试品溶液色谱图中黄芩苷色谱峰进行峰纯度检查，结果见表1，显示黄芩苷峰的纯度角度均小于纯度阈值，说明未包裹共流出物。表明在此色谱条件下，黄芩苷的出峰处均无其他干扰峰，为单一物质峰，方法可行。

对两种供试品溶液中黄芩苷峰的色谱图及光谱图与对照品溶液进行匹配，结果见表1～表2与图1、图4～图5。数据显示，麻杏石甘口服液及杨树花口服液供试品溶液中保留时间18.948 min和18.596 min的色谱峰与黄芩苷对照品的保留时间均一致，且均与对照品的光谱图及最大吸收波长一致，匹配角度均小于匹配阈值。表明两种供试品溶液中相应色谱峰的色谱、光谱与黄芩苷对照品的均一致，为同一物质。

表1 峰纯度及光谱相似度检查结果表

表2 供试品与对照品色谱、光谱结果表

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 通过两种供试品空白试验排除了样品基质对待测物黄芩苷的干扰。同时，峰纯度检查结果显示在此色谱条件下，两种供试品色谱图中黄芩苷峰均为单一物质峰。

2.4.2 检测限 检测限溶液的配制：分别取麻杏石甘口服液和杨树花口服液供试品空白各1 mL，各置100 mL量瓶中，分别精密加入黄芩苷对照品溶液适量(0.5、1、1.5 mL)，用50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。经光谱相似度检查结果显示，测试药物光谱指数图发生轻微变形时仍能实现与光谱库中对照品光谱的匹配，但考虑到兽药非法添加量一般都较大，因此，本检验方法以光谱图失真的最大浓度作为方法的检测限。两种制剂中黄芩苷检测限均为50 mg/L。

2.4.3 准确度 以两种供试品空白中添加被测物对照品(检测限浓度的10倍)做回收率试验来考察方法的准确度，每种供试品重复制备6份，以2.2.1中的对照品溶液作为对照进样，以外标法按峰面积计算回收率。结果显示麻杏石甘口服液中黄芩苷的回收率为99.6%，RSD为0.6%；杨树花口服液中黄芩苷回收率为100.2%，RSD为0.8%。

2.4.4 耐用性 从柱温、色谱柱两个方面考察方法的耐用性。调节柱温分别为25 ℃、30 ℃和35 ℃，结果显示，两种制剂的供试液中黄芩苷保留时间随柱温升高，保留时间有所提前，但测试药物黄芩苷在三种柱温下和相邻色谱峰分离度均大于1.5，且峰面积、拖尾因子、理论塔板数基本没有变化。选择三款不同品牌色谱柱，对两种制剂的供试溶液进样测定，考察不同色谱柱对测定的影响。结果显示，三种品牌色谱柱均可用于该项检查，方法耐用性较好，见表3。

表3 三种色谱柱耐用性考察结果表

3 讨论与结论

3.1 提取溶剂选择 根据药典及文献相关方法，分别考察了水、50%甲醇、甲醇对测试药物黄芩苷的提取效率。即精密量取麻杏石甘口服液供试品1 mL置100 mL量瓶中，分别加入水、50%甲醇、甲醇稀释至刻度，摇匀，进样测定。结果发现，测试药物黄芩苷在50%甲醇中的提取效果优于其他溶剂，最终选择50%甲醇为供试品提取溶剂。

3.2 提取方式选择 为了解提取方式对口服液中测试药物提取效率的影响，精密量取麻杏石甘口服液供试品1 mL置100 mL量瓶中，加50%甲醇适量，分别采取不超声直接稀释至刻度并振摇，超声10 min、超声30 min后放置至室温并稀释至刻度，摇匀，进样测定。结果上述三种提取方式所得测试药物黄芩苷峰面积RSD为0.42%，小于2%。该结果表明，振摇、超声10 min、30 min的提取效率基本一致，为方便实验操作，选择振摇作为本方法测试药物的提取方式。

3.3 非法添加物筛查合理性分析 在以往的中兽药非法添加检查中，发现的添加物多为化学药物成分，而现在市场又出现一种新的极其隐蔽的兽药造假行为，一些不法企业为了提高疗效，私自调整中药处方，在原中药处方中添加处方外的中药成分[4]。该行为不但给动物安全带来很多潜在危害，而且也给检验检测工作带来了更大挑战。本文研究的目标制剂麻杏石甘口服液和杨树花口服液在功效主治方面和黄芩苷有诸多相似之处，但这两种口服液中均不含有黄芩苷[4-7]，而有资料显示[8-9]，黄芩中成分对两种制剂疗效的发挥有一定的协同作用，且市场中已发现杨树花口服液中非法添加黄芩苷的案例。因此上述两种目标制剂中非法添加黄芩苷符合逻辑规律。

3.4 检查方法的扩充使用 除麻杏石甘口服液和杨树花口服液外，其他兽药制剂亦可能非法添加黄芩苷。当采用该检查方法用于其他兽药制剂中非法添加黄芩苷检查时，要注意目标分析物以外的成分是否会对测定产生干扰和添加量是否达到药物发挥药效的可能浓度，需进行空白试验、系统适用性试验及检测限的测定，进而满足检验检测的要求。

试验所建立的方法中，麻杏石甘口服液和杨树花口服液各有效成分对检测无干扰，通过与对照品色谱峰的保留时间进行比对，以及峰纯度及光谱相似度检查来判定两种制剂中是否添加了黄芩苷，方法操作简单、专属性强、灵敏度高、易于推广，能为兽药质量安全监管提供一定的技术保障。