液相色谱-三重四极杆/线性离子阱复合质谱技术检测牛可食性组织中吡利霉素的残留

王亦琳，尹晖，叶妮，孙雷，王鹤佳

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

吡利霉素(Pirlimycin，cas: 79548-73-5)是兽医临床中广泛使用的一种动物专用的林可霉素类抗菌药物，由美国法玛西亚-普强公司(Pharmacia& Upjohn Company)研制，其化学结构式见图1。吡利霉素具有抗革兰氏阳性菌活性，其抗菌谱与林可霉素和克林霉素相似[1]，对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌所致的临床及亚临床型乳腺炎效果明显，弃乳期短，是治疗奶牛乳腺炎尤其是泌乳期乳腺炎的良好药物。临床应用中若使用不当，很容易造成动物可食性组织中的药物残留，引发过敏反应等副作用，危害人类健康。我国农业农村部2019年颁布的食品安全国家标准GB31650-2019《食品中兽药最大残留限量》[2]规定，吡利霉素在牛奶和牛肌肉及脂肪组织中的最高残留限量(MRL)均为100 μg/kg，在牛肾脏组织中的MRL为400 μg/kg，在牛肝脏组织中的MRL为1000 μg/kg。

图1 吡利霉素化学结构式

目前国内外已经报道的吡利霉素的残留分析技术主要有液相色谱-串联质谱法[3-4]和酶联免疫法[5]，但多集中于针对牛奶中的药物残留检测[6-8]，很少有关于动物性食品中该类药物残留检测方法的报道。本文建立了液相色谱-三重四极杆-线性离子阱复合质谱检测方法，以满足吡利霉素在牛肌肉、脂肪、肾脏和肝脏等4种牛可食性组织中的残留检测要求。

1 材料与方法

1.1 仪器 日本岛津公司Shimadzu 30A液相色谱仪-美国AB SCIEX公司QTrap 6500质谱仪(配电喷雾离子源)； AE260电子天平，Mettler Toledo公司； Biofuge Strators高速冷冻离心机，贺利氏公司； SIR4涡旋混合器，IKA公司；固相萃取装置，Waters公司。

1.2 药品和试剂 吡利霉素对照品，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，含量≥98.0%；甲酸(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)，美国Fisher公司；无水硫酸钠(分析纯)、氯化钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；captiva EMR-Lipid固相萃取柱：300 mg/3 mL，美国Agilent公司；所用水为超纯水。

1.3 标准溶液配制 精密称取吡利霉素对照品约10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释成浓度为1 mg/mL的吡利霉素标准储备液；精密量取1 mg/mL的吡利霉素标准储备液100 μL于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释成浓度为10 μg/mL的吡利霉素标准工作液；精密量取10 μg/mL的吡利霉素标准工作液1 mL于10 mL量瓶中，用5%甲酸乙腈溶液溶解并稀释成浓度为1 μg/mL的吡利霉素标准工作液。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品的提取 称取试料(2±0.02)g于50 mL离心管中，加入陶瓷均质子，加5%甲酸乙腈10 mL，涡旋30 s混匀后，加入无水硫酸钠4 g和氯化钠1 g，涡旋30 s混匀后，在4 ℃下以8000 r/min离心8 min，转移上清液2.4 mL至另一50 mL离心管中，加水0.6 mL，混匀，备用。

1.4.2 样品的净化 取备用液过captiva EMR-Lipid小柱，挤干，收集滤液，过微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件 色谱柱为kinetex F5(50 mm×3.0 mm，2.6 μm)，流动相A相为0.1%甲酸水溶液；B相为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱：0～1 min保持10% B；1～3 min，10% B线性变化到90% B；3～4 min保持90% B；4～5 min保持10% B；流速：0.4 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

1.5.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI+)；电喷雾电压为5500 V；离子源温度为500 ℃；辅助气1为50 psi；辅助气2为50 psi；气帘气为30 psi；碰撞气为High；检测方式为多反应监测联合信息依赖性采集与增强子离子扫描模式(MRM-IDA-EPI)。吡利霉素定性、定量离子对及对应的去簇电压、碰撞能量参考值见表1。IDA参数：①使用动态背景扣除功能；②从不排除之前的目标离子；③触发阈值：100cps。EPI参数：①扫描范围：m/z100～400；②扫描速度：10000 Da/s；③CE：35ev；CES：15ev。

表1 吡利霉素MRM参数

1.6 基质匹配标准曲线的制备 精密量取适宜浓度的吡利霉素标准工作液适量，用提取净化后的空白试料滤液稀释成含药物浓度分别为1、2、5、10、100和400 ng/mL的系列基质匹配标准工作液(肌肉和脂肪采用1、2、5、10和100 ng/mL的浓度点，肾脏和肝脏采用1、2、5、10、100和400 ng/mL的浓度点)，从中各取1.0 mL，过微孔滤膜，作为基质匹配标准溶液上机测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，基质匹配标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程及相关系数。

1.7 方法准确度及精密度的测定 采用标准添加法，在空白牛肌肉、脂肪、肾脏和肝脏中添加低、中、高浓度的吡利霉素标准工作液。在牛肌肉和牛脂肪中的添加浓度为10、100、200 μg/kg；在牛肾脏中的添加浓度为10、400、800 μg/kg；在牛肝脏中的药物浓度为10、1000、2000 μg/kg。每种浓度5个样品平行试验，重复3批次，按照1.4样品前处理方法处理之后上机测定，基质匹配标准溶液外标法定量，计算回收率、批内、批间变异系数。

1.8 方法灵敏度确定 添加适量浓度的吡利霉素标准工作液于2 g空白牛肌肉、脂肪、肾脏和肝脏组织中，经前处理后测定，观察药物特征离子质量色谱峰信噪比(S/N) 和对应药物浓度，以 S/N>3(按PtP算)作为方法的检测限，S/N>10(按PtP算)作为方法的定量限。

2 结果与分析

2.1 定性分析 在一般的MRM检测模式中，通常选择一个母离子和两个响应较强的子离子进行定性分析。但在残留检测的实际工作中，由于待测样品的基质比较复杂，检测中经常会出现假阳性峰，影响定性的准确性。本研究采用MRM-IDA-EPI检测模式，可以得到目标子离子的二级子离子全扫描质谱图(EPI图)，通过与对照溶液的EPI图进行对比，可以更为准确地做出定性判断。图2是吡利霉素阳性添加样品和对照溶液的EPI图对比，可以发现两者的特征子离子匹配度很高。按照一个母离子1个识别点(IP)点，一个子离子1.5个IP点计算，图2中有6个特征子离子，共10个IP点，超出欧盟2002/657/EC[9]规定的有最大残留限量兽药兽药确证检测至少需要3个IP点的要求，提高了复杂基质中定性的准确性。

1: 吡利霉素空白牛肝添加样品; 2: 吡利霉素对照溶液 1: Blank cattle kidney sample added with pirlimycin; 2: Standard solution of pirlimycin

2.2 基质匹配标准曲线 以吡利霉素的特征离子质量色谱峰面积与其对应的基质匹配标准溶液浓度作图，得到相应的标准曲线，线性回归方程及相关系数(R2)见表2。吡利霉素于牛肌肉和脂肪中在1～100 ng/mL的浓度范围内，于牛肾脏和肝脏中在1～400 ng/mL浓度范围内，特征离子质量色谱峰面积与浓度均呈良好的线性关系，R2均>0.990。

表2 空白牛可食性组织中吡利霉素的回归方程和相关系数

2.3 方法灵敏度 按1.8中所述方法进行处理，依据吡利霉素特征离子质量色谱峰信噪比S/N>3和S/N>10分别为方法的检测限和定量限，得出在空白牛肌肉、脂肪、肾脏和肝脏组织中，吡利霉素的检测限均为5 μg/kg，定量限均为10 μg/kg。4种空白牛组织基质匹配标准溶液中吡利霉素的特征离子质量色谱图见图3。

2.4 方法准确度及精密度 在空白牛肌肉、脂肪、肾脏和肝脏中各添加3个不同浓度的吡利霉素标准工作液进行回收率试验，。结果表明，吡利霉素在牛肌肉和牛脂肪10～200 μg/kg，牛肾脏10～800 μg/kg，以及牛肝脏10～2000 μg/kg添加浓度水平上的回收率在60.2%～101%范围内；批内与批间RSD均小于13%。结果见表3。

1: 空白牛肌肉; 2: 空白牛脂肪; 3: 空白牛肾脏; 4: 空白牛肝脏 1: Blank cattle muscle; 2: Blank cattle fat; 3: Blank cattle kidney; 4: Blank cattle liver

表3 空白牛可食性组织中吡利霉素添加的回收率(n=5)

3 讨论与结论

3.1 提取条件的选择 试验中最先参考已报道的牛奶中吡利霉素残留检测的提取方法[6]，在样品中直接加入甲酸乙腈提取液涡旋混合，结果发现该方法易使组织快速成团，难以将其中的药物残留充分提取，大大降低了回收率。经过反复尝试，最后采用以下方法：根据称样量，选择适宜体积的5%甲酸乙腈提取一次，同时在离心管中加入了陶瓷均质子，可以使组织足够散碎，充分与甲酸乙腈接触，大大提高吡利霉素的提取率。加入了无水硫酸钠和氯化钠，可以有效吸收组织中的水分。同时通过高速离心又能很好地去除蛋白质等大量杂质的干扰，并且在不影响回收率的前提下尽可能减少过柱体积，为实际应用过程中进行大批量样品检测节省了时间，提高了检测效率。

3.2 净化条件的选择 根据吡利霉素的理化性质，试验首先考察了MCX柱和HLB柱的净化效果，然而在试验过程中发现上述两种小柱都比较耗时且回收率较低。通过多次尝试和比较，最后确定采用直接过captiva EMR-Lipid小柱，收集滤液进行净化，滤液可以直接过滤膜后上机检测，省去了活化、淋洗和吹干的步骤，为实际应用过程中大批量样品检测时节省时间提供了便利。

3.3 定性方法的选择 由于本文的分析对象牛肌肉、脂肪、肾脏、肝脏均属于动物源性样品，基质比较复杂，在使用一般的MRM方法进行样品检测时，目标分析物容易受到复杂基质的干扰影响。样品中离子对丰度比与对照溶液相比，容许偏差易超出欧盟2002/657/EC[9]中的规定，影响定性的准确性。因此我们建立了MRM-IDA-EPI的质谱分析方法。利用仪器的线性离子阱(Trap)功能在第三重四极杆处(Q3)进行子离子的富集扫描[10-11]，在使用MRM定量的同时，得到目标子离子的二级质谱全扫描图，丰富了样品定性所需要的质谱数据，提高了方法的选择性[12-15]。

3.4 定量方法的选择 该方法针对牛肌肉、脂肪、肾脏、肝脏，在进行前处理后上机测试发现有一定的基质效应。因此在定量方法选择时采用了基质匹配标准溶液法进行定量，可以有效消除基质效应的影响，提高方法定量的准确性。

本文采用液相色谱-三重四极杆/线性离子阱复合质谱技术建立了一种可检测牛肌肉，脂肪，肾脏和肝脏中吡利霉素残留的分析方法。该方法在进行常规的MRM采集同时，采用IDA-EPI模式又可以获得目标分析物子离子的完整二级质谱信息，同时实现了定性和定量，可以有效防止假阳性的产生。同时该方法具有良好的可操作性和重现性，方法准确度，灵敏度和精密度均能满足兽药残留分析方面的要求。