REST4对胶质细胞瘤U87细胞生物学行为的影响及其作用机制

李华顺 牛东生 曹少祥

作者单位：431700 天门 1天门市第一人民医院病理科；056004 邯郸 2邯郸市第一医院肿瘤内科；431700 天门 3天门市第一人民医院普外科

胶质细胞瘤又称为神经胶质瘤，是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤，占恶性脑肿瘤的35%～40%。胶质细胞瘤患者一般手术切除后进行放疗或化疗，但术后复发率极高，中位复发时间为6.9个月，中位生存期仅为14.6个月，且治疗过程中易对传统治疗抵抗，预后极差［1-3］。因此，明确胶质细胞瘤的发病机制，寻找有效的药物治疗靶点成为目前亟需解决的难题。REST4基因是抑制元素l-沉默转录因子（repressor element 1-silencing transcription factor，REST）前体mRNA通过插入或缺失方式产生的一种剪切异构体。目前研究显示REST4基因在小细胞肺癌［4-5］、神经胶质瘤［6］、乳腺癌［7］等肿瘤中过表达，可能是肿瘤细胞异常增殖及恶化进展的关键基因［8-9］。PI3K/AKT/mTOR信号通路是细胞生长、增殖、分化及凋亡等生理过程中重要的信号通路［10-11］，已经证实该信号通路的过度激活与多种肿瘤发生［12-14］及增殖、转移等［15-16］病理过程密切相关。因此，推测REST4基因可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控胶质细胞瘤增殖、凋亡及转移等生物学行为。本研究以胶质细胞瘤U87细胞为研究对象，采用RNA干扰技术下调REST4基因构建稳定转染细胞株，初步探讨REST4基因对U87细胞增殖、凋亡及迁移的影响，为进一步探讨REST4基因在胶质细胞瘤中的作用及分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

胶质细胞瘤U87细胞购自中科院上海细胞库；PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 和 GAPDH抗体均购自Proteintech公司；REST4抗体购自艾博抗贸易有限公司；细胞凋亡检测试剂盒、DMEM培养基、RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天公司；RNA提取试剂盒和逆转录cDNA试剂盒均购自Promega公司；Matrigel基质胶购自北京索莱宝科技有限公司；REST4-siRNA及引物购自上海吉玛制药技术有限公司；ECL显色液、LipofectamineTM2000均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；流式细胞仪购自北京岛津公司；双垂直电泳仪、转印电泳仪、凝胶成像仪均购自伯乐生命医学产品有限公司。

1.2 细胞培养与转染

U87细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养，每天更换新鲜培养液，待细胞生长融合至70%～80%进行传代。按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书的方法，将REST4-siRNA及其阴性对照（si-NC）转染至U87细胞，定义为si-REST4组和si-NC组；同时设置空白对照组（Control组）。培养4～6 h后更换新鲜完全培养基，继续培养24 h后，收集各组细胞进行后续实验。

1.3 实时荧光定量PCR检测U87细胞中REST4 mRNA的表达

用RNA提取试剂盒分别提取各组细胞中的总RNA，将提取的总RNA按照逆转录试剂盒说明书的操作步骤逆转录为cDNA，然后用实时荧光定量PCR检测各组细胞中REST4的mRNA水平。PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10 μL，4×dNTPs 8 μL，引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL（10 ng），Taq DNA 聚合酶 1 μL，加水至终体积为100 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，共 30个循环；72℃再延伸10 min。PCR引物序列：REST4 Forward 为 5′-GAGGCGTGGCAGACTATGC-3′，Reverse为 5′-CTTGTACTCCGTCAGCGTGA-3′；GAPDH Forward为 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，Reverse 为5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。采用 2-△△Ct法，以GAPDH为内参计算REST4 mRNA的相对表达水平。实验重复3次。

1.4 MTT法检测U87细胞的增殖能力

将转染后的各组细胞以1×104/mL的密度接种至96孔板（200 μL/孔）中，每组设置6个复孔。将96孔板置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养，分别于培养24 h、48 h、72 h后，在避光环境下加入5 mg/mL的MTT 溶液（20 μL/孔），避光孵育 4 h，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡5 min，用酶标仪检测波长490 nm处的吸光度（OD）值。实验重复3次。

1.5 Annexin V-FITC/PI双染法检测U87细胞凋亡情况

将转染后的各组细胞以1×104/mL的密度接种至6孔板，培养48 h后，加入不含EDTA的胰酶消化。收集细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，重悬细胞后，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入200 μL AnnexinV-FITC结合液重悬细胞，室温避光孵育15 min，加入10 μL PI染色液，混匀，室温避光孵育10～20 min后置于冰浴中，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复3次

1.6 划痕实验检测U87细胞的迁移能力

将转染后的各组细胞接种至Matrigel基质胶包被的96孔板（1×104/孔）中常规培养，待单层细胞形成，用无菌10 μL移液枪枪头沿培养板底部在单层细胞上笔直划痕，继续培养24 h，在显微镜下记录 0 h、24 h的划痕相对距离，计算细胞迁移率。实验重复3次。

1.7 Western blot检测U87细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关因子的表达水平

将转染后的各组细胞接种至6孔板（1×104/孔），培养48 h后，收集细胞，分别加入裂解液提取总蛋白后，用BCA法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，室温封闭1 h，分别加入一抗（REST4、PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR抗体，稀释比例均为1：1 000），4℃孵育过夜，PBST 洗膜后，加入二抗（1：2 000），室温孵育 1 h，用PBST清洗，加入ECL显色液显影，采用凝胶成像仪成像后，应用Image J软件检测免疫印迹灰度值。实验重复3次。

1.8 统计学方法

采用SPSS 19.0软件和GraphPad Prism 5软件对数据进行分析和作图。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey检验。以双侧P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后U87细胞中REST4 mRNA及蛋白表达水平

实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示，与Control组和si-NC组相比，si-REST4组REST4的mRNA及蛋白表达水平均降低（P＜0.05），而Control组与si-NC组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），提示REST4-siRNA转染成功，可用于后续实验。见图1。

2.2 下调REST4对U87细胞增殖能力的影响

MTT法检测结果显示，与Control组及si-NC组相比，si-REST4组U87细胞24 h、48 h及72 h时的OD值均降低（P＜0.05），而Control组和si-NC组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图1 U87细胞中REST4 mRNA及蛋白的表达水平Fig.1 Expressison of REST4 mRNA and protein in U87 cells

图2 REST4对U87细胞增殖能力的影响Fig.2 Effect of REST4 on the proliferation of U87 cells

2.3 下调REST4对U87细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC/PI双染法检测结果显示，与Control组及si-NC组相比，si-REST4组U87细胞凋亡比例增加（P＜0.05），但Control组与si-NC组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 REST4对U87细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of REST4 on the apoptosis of U87 cells

2.4 REST4对U87细胞迁移能力的影响

划痕实验检测结果显示，与Control组及si-NC组相比，si-REST4组U87细胞的迁移率降低（P<0.05），而Control组与si-NC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4。

图4 REST4对U87细胞迁移能力的影响Fig.4 Effect of REST4 on the migration of U87 cells

2.5 REST4对U87细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平的影响

Westernblot检测结果显示，与Control组及si-NC组比较，si-REST4组U87细胞中PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白水平均降低（P<0.05）；而 Control组与si-NC组比较各蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 5。

图5 REST4对U87细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平的影响Fig.5 Effect of REST4 on the expression of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway related proteins in U87 cells

3 讨论

REST又称为神经元限制性沉默因子，是神经元特异性表达的负向调控因子，存在广泛的选择性剪切现象。目前研究发现REST及其剪切体REST4在多种肿瘤中发挥双重作用，而在胶质瘤中主要作为致癌因子发挥作用［17］。最近研究发现REST4在一些肿瘤组织和细胞系中表达，并在发病机制中发挥重要作用［18］。如有研究发现胶质细胞瘤患者REST4高表达与其预后不良有关，其原因为REST4高表达抑制神经元细胞向胶质细胞的分化，进而诱导胶质细胞瘤形成，同时，REST4表达水平升高能够降低胶质细胞瘤患者化疗敏感性，缩短总生存期［19］。WAGONER 等［20］也报道REST4高表达患者表现出更明显的侵袭性。REN等［21］通过研究REST4在胶质瘤患者肿瘤组织及U87、U251细胞中的表达，发现在胶质瘤组织及U87、U251细胞中REST4表达上调，而抑制REST4的表达则能够抑制U87、U251细胞增殖并诱导细胞凋亡。本研究通过RNA干扰技术下调REST4基因表达后构建了稳定转染U87细胞，功能实验发现下调REST4可使细胞增殖能力和迁移降低并诱导细胞凋亡，提示REST4可能参与胶质细胞瘤的发生发展。

研究表明，PI3K/AKT/mTOR信号通路与胶质细胞瘤的发生及发展密切相关，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活，能够诱导胶质细胞瘤细胞凋亡，引起细胞周期阻滞，抑制细胞迁移和侵袭，从而抑制肿瘤生长［14-16］。因此，本研究进一步采用Western blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关因子的表达水平，发现下调 REST4后 U87细胞中 PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平降低，提示REST4可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控胶质细胞瘤的增殖与凋亡，有望成为胶质细胞瘤潜在的治疗靶点。

综上所述，下调REST4基因表达可抑制胶质细胞瘤细胞增殖和迁移并诱导细胞凋亡，分子机制可能是通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路实现，但这一作用机制有待今后进一步在其他细胞系及体内实验中证实。