miR-572通过靶向调控WWOX影响肺癌细胞恶性生物学行为

余园园 雷怀定 吴呈霖 赵苏 王梅芳

作者单位：442000 十堰 1十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院）呼吸与危重症医学科；430014 武汉 2武汉市中心医院呼吸内科

肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，确诊时多数患者分期较晚，病情进展迅速，总体预后较差［1］。但是目前肺癌发生、发展的分子机制尚未完全明确［2-4］。miR-572是一种高度保守的微小RNA（miRNAs），已被报道在卵巢癌［5］、结直肠癌［6］等中多种肿瘤中表达上调，且可促进癌细胞生长。氧化还原酶的WW结构域（WW domain containing oxidoreductase，WWOX）是近年发现的一个新的候选抑癌基因，在包括肺癌等多种肿瘤中均发现其异常表达，其中在肺癌中上调其表达可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡［7］。而本课题组前期通过生物信息学数据库Targetscan预测发现WWOX可能是miR-572的靶基因，两者互为靶向关系。本研究探讨miR-572对肺癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响及其与WWOX的靶向关系，以期阐明miR-572在肺癌中的作用及其调控机制。

1 材料与方法

1.1 组织标本、细胞系及主要试剂

收集2016年3月—2018年5月十堰市太和医院手术切除的肺癌组织及其相应的癌旁组织各50例，均经组织病理学检查确诊，本研究经医院伦理委员会审批通过，患者知情同意。

肺癌细胞 A549、L9981和正常肺上皮细胞BEAS-2B均购自上海康朗生物科技有限公司。miR-572 inhibitor、miR-572 mimics及相应阴性对照（inhibitor control、mimics control）、WWOX siRNA 及其阴性对照（siRNA control）均由生工生物工程（上海）股份有限公司构建；WWOX野生型载体（WWOX-WT）和WWOX突变型载体（WWOX-MUT）由江苏百奥迈科生物技术有限公司合成；miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRNA荧光定量检测试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；第一链cDNA合成试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；SYBR定量PCR试剂盒购自上海欣百诺生物科技有限公司；WWOX抗体购自武汉艾美捷科技有限公司；BCA蛋白定量检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；荧光素酶活性测定试剂盒购自美国GeneCopoeia。

1.2 细胞培养与转染

细胞置于含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h备用。

按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书操作步 骤 将 miR-572 inhibitor、inhibitor control、miR-572 mimics、mimics control、WWOX siRNA 和 siRNA control分别转染A549和L9981细胞，分别定义为和AntimiR-572组、Anti-NC组、miR-572组、miR-NC组、si-WWOX组和si-NC组；同时将miR-572 inhibitor与 WWOX siRNA、miR-572 inhibitor与 siRNA control分别共转染至A549和L9981细胞，分别定义为和Anti-miR-572+si-WWOX组Anti-miR-572+si-NC组；以未转染的细胞为正常对照组（Control组）。各组细胞培24 h后更换新的培养基，继续培养48 h，收集各组细胞进行后续实验。

1.3 qRT-PCR法检测肺癌组织和细胞系中miR-572和WWOX mRNA的表达

用Trizol试剂提取肺癌组织和细胞系中的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书的方法将RNA逆转录为cDNA后，根据荧光定量检测试剂盒说明书操作步骤进行PCR反应。PCR反应体系：2 mmol/L dNTP mixture 1 μL，Buffer 2.5 μL，Tag 酶 0.2 μL，引物 TGFβ1 KpnIF 0.5 μL，引物 TGFβ1 XhoIR 0.5 μL，ddH2O 19.3 μL，DNA 1 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性 10 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 10 s，共30个循环。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，其中U6 Forward为5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，Reverse 为 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；miR-572 Forward 为 5′-GGGCAAAGACATGGAGGAGG3′，Reverse 为 5′-CGCTGGCTTGGCTTCTGACT-3′；GAPDH Forward 为 5′-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，Reverse 为 5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′；WWOX Forward 为 5′-GACTGGCGTTTACTGTGGATGA-3′，Reverse 为 5′-CAAAAGACTTGGCGGTTTCG-3′。采用 2-△△Ct法，分别以U6、GAPDH为内参计算miR-572 mRNA和WWOX mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.4 MTT法检测肺癌A549、L9981细胞的增殖能力

转染48 h后将A549、L9981细胞分别接种至96孔板，设立3个复孔，于37℃，5% CO2培养箱中培养 24 h、48 h、72 h、96 h 后，每孔分别加入 10 μL MTT工作液，继续培养4 h；加入150 μL的二甲基亚砜溶液，振荡10 min，在酶标仪上测定490 nm波长处的光密度（OD）值，绘制细胞生长曲线。

1.5 流式细胞仪检测肺癌A549、L9981细胞周期

收集转染48 h后的各组细胞，设立3个复孔，以0.25%的胰蛋白酶消化后，离心，弃上清液，以预冷的PBS重悬细胞2次，75%的乙醇固定18 h，再用预冷的 PBS洗涤 2次，加入 10 μL RNA 酶、300 μL PI染色液，充分混匀，于室温、避光孵育30 min后，用流式细胞仪测定细胞周期。

1.6 流式细胞仪检测肺癌A549、L9981细胞凋亡情况

收集转染48 h后的各组细胞，设立3个复孔，以0.25%的胰蛋白酶消化后，离心，弃上清液，以预冷的PBS重悬细胞2次，加入结合缓冲溶液调整细胞悬液浓度为1×106/mL。取1 mL的细胞悬浮液转移至EP管中，加入体积为5 μL的PI、Annexin V-FITC溶液，吹打混合，于室温、避光孵育15 min，再加入400 μL结合缓冲溶液，混匀后采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 荧光素酶报告基因实验验证miR-572和WWOX的靶向关系

采用生物信息学软件Targetscan分析miR-572和WWOX的3′UTR端的互补结合位点。将WWOX-WT和 WWOX-MUT分别与 miR-572 inhibitor、inhibitor control、miR-572 mimics、mimics control共转染至肺癌A549、L9981细胞中，设立3个复孔，培养48 h后，采用荧光素酶活性测定试剂盒测定细胞的荧光素酶活性。

1.8 Western blot检测肺癌A549、L9981细胞WWOX蛋白表达水平

收集培养48 h后的各组细胞，设立3个复孔，用含有PMSF的RIPA蛋白裂解试剂提取细胞总蛋白，用BCA法进行蛋白浓度定量，然后进行SDS-PAGE电泳，转移至NC膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h；加入一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；加入二抗（1∶2 000）室温孵育2 h，在避光条件下用ECL发光试剂盒进行凝胶成像。采用Image J软件测定蛋白条带的灰度值，以GAPDH为内参进行目的蛋白相对定量。

1.9 统计学方法

采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 7.0软件分析实验数据，计量数据以均数±标准差（±s）表示，肺癌组织和正常癌旁组织中miR-572的表达水平比较采用配对t检验；多组间比较用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，进一步采用LSD-t检验进行两两比较。采用Pearson相关性分析法分析miR-572与WWOX的关系。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-572在肺癌组织和细胞中的表达

qRT-PCR检测结果显示，肺癌组织中miR-572表达水平高于癌旁组织（t=43.601，P=0.004），见图 1A。A549、L9981细胞中miR-572的表达水平高于正常肺上皮细胞 BEAS-2B（F=6.125，P=0.004），见图 1B。

图1 qRT-PCR检测miR-572在肺癌组织和细胞中的表达Fig.1 Expression of miR-572 in lung cancer tissues and cells detected by qRT-PCR

2.2 miR-572对肺癌细胞增殖、周期和凋亡的影响

qRT-PCR检测结果显示，转染miR-572 inhibitor后，A549、L9981细胞中miR-572的表达水平均降低（t=5.247，P＜0.001；t=5.749，P＜0.001）；转染 miR-572 mimics后，A549和L9981细胞中miR-572的表达水平均升高（t=5.414，P＜0.001；t=6.116，P＜0.001）。见图 2。

MTT法检测结果显示，与Anti-NC组相比，下调miR-572后A549、L9981细胞增殖能力降低（t=3.249，P=0.002；t=3.171，P=0.004）；与 miR-NC 组相比，上调miR-572后A549、L9981细胞增殖能力增强（t=4.051，P=0.001；t=4.118，P=0.001），见图 3A。流式细胞仪检测结果显示，与Anti-NC组相比，下调miR-572明显增加 A549、L9981细胞 G0/G1期比例（t=4.419，P=0.001；t=4.888，P＜0.001）和凋亡率（t=22.112，P＜0.001；t=32.068，P＜0.001）；与miR-NC组相比，上调miR-572明显降低肺癌细胞A549、L9981的G0/G1期比例（t=-4.342，P=0.001；t=-3.931，P=0.002）和凋亡率（t=-13.554，P＜0.001；t=-22.272，P＜0.001）。见图 3B～C。

2.3 miR-572靶向调控WWOX

qRT-PCR和Western blot检测结果显示，肺癌组织中WWOX mRNA和蛋白的表达水平均低于正常癌旁组织（t=7.621，P＜0.001；t=6.457，P＜0.001）；细胞A549、L9981中WWOX mRNA和蛋白的表达水平均低于正常肺上皮细胞BEAS-2B（F=7.584，P=0.020；F=5.661，P=0.005）。见图 4A～D。

生物信息学软件Targetscan分析发现miR-572和WWOX的3′UTR端存在互补结合位点，见图4E。荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-572和WWOX互为靶向关系，miR-572能特异结合WWOX3′UTR并在转录后水平下调WWOX基因表达，见图4F。

Western blot检测结果显示，与Anti-NC组相比，下调miR-572可上调A549、L9981细胞WWOX蛋白表达水平（t=2.147，P=0.011；t=3.092，P=0.007）；与miR-NC相比，上调miR-572可下调A549、L9981细胞中 WWOX 蛋白表达水平（t=5.223，P＜0.001；t=4.597，P＜0.001），见图4G。Pearson相关分析显示，肺癌组织中WWOX和miR-572表达呈负相关（r=-0.669，P＜0.001），见图4H。提示miR-572可靶向负调控WWOX表达。

2.4 WWOX逆转miR-572对肺癌细胞增殖、周期和凋亡的影响

Western blot检测结果显示，转染WWOX siRNA后A549、L9981细胞中WWOX蛋白水平降低（t=6.334，P＜0.001；t=5.327，P＜0.001），见图 5。MTT 法和流式细胞仪检测结果显示，与si-NC组相比，转染WWOX siRNA后A549、L9981细胞增殖能力增强（t=8.125，P＜0.001；t=7.641，P＜0.001），G0/G1 期细胞比例降低（t=5.967，P＜0.001；t=4.988，P＜0.001），细胞凋亡率降低（t=7.246，P＜0.001；t=7.144，P＜0.001），见图 6。与Anti-miR-572+si-NC组相比，共转染WWOX siRNA与miR-572 inhibitor后A549、L9981细胞的增殖能力增强（F=3.839，P=0.024；F=4.122，P=0.018），G0/G1 期细胞比例降低（F=4.325，P=0.016；F=4.264，P=0.016），细胞凋亡率降低（F=6.352，P=0.003；F=5.477，P=0.006），见图7。

图2 qRT-PCR检测转染后肺癌A549和L9981细胞中miR-572的表达水平Fig.2 Expression of miR-572 in lung cancer A549 and L9981 cells after transfection detected by qRT-PCR

图3 miR-572对肺癌A549和L9981细胞增殖、周期和凋亡影响Fig.3 Effect of miR-572 on proliferation，cycle and apoptosis of lung cancer A549 and L9981 cells

图4 WWOX在肺癌组织和细胞中的表达及其与miR-572的关系Fig.4 WWOX expression in lung cancer and its correlation with miR-572 expression

图5 Western blot检测WWOX siRNA转染后肺癌A549、L9981细胞中WWOX蛋白的表达Fig.5 WWOX protein expression in lung cancer A549 and L9981 cells after WWOX siRNA transfection detected by Western blot

图6 WWOX对肺癌细胞增殖、周期和凋亡的影响Fig.6 Effects of WWOX on proliferation,cycle and apoptosis of lung cancer cells

3 讨论

图7 WWOX逆转miR-572对肺癌细胞增殖、周期和凋亡的影响Fig.7 Effects of WWOX reversal miR-572 on proliferation,cycle and apoptosis of lung cancer cells

miRNAs是一类小分子非编码RNA，其异常表达已被证实与多种恶性肿瘤的发生发展有关［8-10］，在细胞分化、增殖、凋亡等生物学进程中发挥重要的调控作用［11］，有望成为肿瘤治疗的理想靶标。miR-572作为一种高度保守的miRNA，在人体组织中普遍表达，也与肿瘤发生发展密切相关且可能发挥促癌作用。PAN等［12］研究发现，miR-572在肾癌组织和细胞中高表达，且上调miR-572后肾癌细胞增殖能力增强，细胞凋亡水平下降。本研究同样发现miR-572在肺癌组织和细胞中高表达，下调miR-572后肺癌细胞增殖能力下降，细胞G0/G1期比例升高，而细胞凋亡增多，提示miR-572在肺癌中发挥促癌作用。

既往研究报道miRNA发挥作用往往通过调控下游靶基因实现［13-17］。WWOX定位在16q23.3染色体上，由1个内含子和9个外显子组成，在乳腺癌、食管鳞状细胞癌及肝细胞癌等表达下调，且发挥抑癌基因作用［18-21］。DONATI等［22］在肺癌研究中发现，上调WWOX表达可以降低细胞增殖能力，促进细胞凋亡。本研究首先利用生物信息学软件Targetscan预测miR-572与WWOX的结合位点，然后通过荧光素酶报告基因检测证实miR-572与WWOX的靶向关系，且相关性分析显示两者表达呈负相关，推测miR-572可能通过靶向WWOX影响肺癌细胞生长。进一步检测WWOX在肺癌组织和细胞中的表达及进行细胞功能实验，发现均呈低表达，下调WWOX后细胞增殖能力增强，细胞G0/G1期比例降低，细胞凋亡减少，同时可逆转下调miR-572对肺癌细胞增殖抑制、周期阻滞和凋亡诱导作用，进一步证实miR-572可能通过靶向调控WWOX影响肺癌细胞的生长和凋亡。

综上所述，miR-572在肺癌中高表达，下调其表达可降低肺癌细胞增殖能力，阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡，其作用机制可能与靶向调控WWOX有关，miR-572可能是肺癌潜在的诊断标志物及治疗分子靶点。