西达本胺对利妥昔单抗耐药B细胞淋巴瘤增殖的影响及作用机制

柯晴 罗瞾 岑洪

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院淋巴血液及儿童肿瘤内科

B细胞淋巴瘤是一种起源于B淋巴细胞的淋巴瘤，临床上常见的类型包括弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤及套细胞淋巴瘤［1］。利妥昔单抗联合标准化疗治疗B细胞淋巴瘤取得了理想的疗效，但仍有20%～30%的患者因肿瘤耐药死亡［2］。利妥昔单抗是基因工程人鼠嵌合单克隆抗体，作用于淋巴细胞表面的CD20抗原，可显著改善滤泡性淋巴瘤患者生存期，也使更多的侵袭性B细胞淋巴瘤患者得到根治机会。在临床上虽然许多患者初始治疗对利妥昔单抗敏感，但最终仍会复发，因此利妥昔单抗获得性耐药已成为B细胞淋巴瘤治疗面临的最大挑战之一。西达本胺是我国自主设计和制造的新一代酰胺类组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，通过表观遗传调控机制，恢复耐药肿瘤细胞对药物的敏感性［3］。临床上观察到西达本胺对复发/难治性B细胞淋巴瘤患者有效［4］，但其作用机制仍不明确。本研究探讨西达本胺在体外对利妥昔单抗耐药的B细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1/R增殖的影响及其可能的作用机制，为耐药B细胞淋巴瘤的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

B细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1购自中国科学院上海细胞库，Jeko-1/R细胞由亲本Jeko-1细胞经利妥昔单抗体外浓度梯度递增方式培养诱导构建而成。细胞置于含100 U/mL青霉素-链霉素，10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5% CO2培养箱中培养。Jeko-1/R细胞培养于含50 μg/mL利妥昔单抗的培养基中维持耐药表型［5］。

RPMI 1640细胞培养液及胎牛血清购自美国Gibco公司。细胞增殖与毒性检测试剂盒（CCK-8）购自上海七海复泰公司。RNA逆转录酶试剂盒购自日本TaKaRa公司。抗乙酰化H3、H4抗体、内参β-actin及其相对应的二抗均购自Abcam公司。健康人血清作为人补体来源。利妥昔单抗（rituximab，美罗华，10mg/mL）为商品化的罗氏公司产品。西达本胺由深圳微芯公司赠送，溶于DMSO配置成10 mmol/L的储存液，保存在-20℃冰箱。

1.2 CCK-8法检测药物对细胞增殖的影响

取对数生长期的Jeko-1和Jeko-1/R细胞，调整细胞密度为5×104/mL，以每孔100 μL接种于96孔板。实验设置对照组和不同浓度用药组，其中单药组分别加入 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和 200 μg/mL利妥昔单抗或 4 μmol/L、8 μmol/L 和 16 μmol/L西达本胺；两药联合组加入100 μg/mL利妥昔单抗及8 μmol/L西达本胺，对照组接种细胞但只给予同体积的培养基而不加药物，另设不含细胞只含培养基的空白对照组。分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂继续培养2 h。用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度（OD），计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=［（OD对照-OD实验）/（OD对照-OD空白）］×100%。实验重复3次。

1.3 RT-PCR检测细胞CD20mRNA的表达水平

取培养48h后的各组细胞，按TRIzol试剂说明书提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明书制备cDNA。取1 μL cDNA配制RT-PCR体系进行PCR检测。引物序列由上海生工生物公司设计和合成，以GAPDH为内参。引物序列：GAPDH上游为 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游为 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′；CD20 上游为 5′-ATGAAAGGCCCTATTGCTATG-3′，下游为 5′-GCTGGTTCACAGTTGTATATG-3′。PCR反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火延伸1 min，扩增40个循环。扩增结束后制作融解曲线。采用2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量。每个样本独立重复实验3次。

1.4 Western blot法检测组蛋白H3、H4乙酰化水平

取Jeko-1/R细胞，加入不同浓度（0μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L）西达本胺，48 h 后收集细胞并提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取40～60 μg蛋白上样，SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后，分别加入相应一抗（稀释比例1∶1 000），4℃孵育过夜。次日加入二抗（稀释比例 1∶8 000），室温孵育60 min，用显色剂显色成像。用Image Lab软件对目的条带和内参条带测量灰度值，以目的条带与内参条带的灰度值比值表示对应蛋白的表达水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示，两组均数比较采用独立样本t检验；多组均数比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，进一步的多重比较采用Dunnett′s t检验。本研究以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单药利妥昔单抗和西达本胺对Jeko-1和Jeko-1/R细胞增殖的影响

CCK-8实验结果显示，不同浓度（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL）利妥昔单抗和（4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L）西达本胺分别单独处理Jeko-1细胞48 h后均呈剂量依赖式抑制细胞增殖，组间差异均有统计学意义（F=38.533，P<0.001；F=17.968，P=0.003）。进一步多重比较显示，25 μg/mL利妥昔单抗和4 μmol/L西达本胺处理后的细胞增殖抑制率均低于其余相应药物作用组（均P<0.001）。

不同浓度西达本胺作用48 h后呈剂量依赖式抑制Jeko-1/R细胞增殖，组间差异有统计学意义（F=51.456，P<0.001），且4 μmol/L西达本胺处理后的细胞增殖抑制率均低于其余相应药物作用组（均P<0.001）。但不同浓度西达本胺处理Jeko-1和Jeko-1/R细胞的增殖抑制率差异均无统计学意义（均P>0.05）；而不同浓度利妥昔单抗处理Jeko-1/R细胞的增殖抑制率均低于Jeko-1细胞（均P<0.001），其中当利妥昔单抗作用浓度为 100 μg/mL 时，Jeko-1、Jeko-1/R 细胞增殖抑制率均最高，选择100 μg/mL浓度利妥昔单抗进行后续实验。见图1、图2。

2.2 西达本胺联合利妥昔单抗对Jeko-1和Jeko-1/R细胞增殖的影响

CCK-8实验结果显示，西达本胺联合利妥昔单抗呈时间依赖式抑制Jeko-1和Jeko-1/R细胞增殖，组间差异有统计学意义（F=25.272，P=0.001；F=76.105，P<0.001），多重比较显示，48 h、72 h细胞增殖抑制率均高于24 h（均P<0.01）；各时间点两者联合处理Jeko-1和Jeko-1/R细胞的增殖抑制率差异均无统计学意义（均 P>0.05），见表 1、图 3。48 h时，两者联合处理Jeko-1、Jeko-1/R细胞的增殖抑制率均高于单药西达本胺［（79.57±7.27）%vs（66.49±6.33）%，t=-2.800，P=0.049；（74.35±9.65）%vs（64.15±5.09）%，t=-3.815，P=0.019］。

图1 利妥昔单抗抑制Jeko-1和Jeko-1/R细胞增殖Fig.1 Rituximab inhibited the proliferation of Jeko-1 and Jeko-1/R cells

图2 西达本胺抑制Jeko-1和Jeko-1/R细胞增殖Fig.2 Chidamide inhibited the proliferation of Jeko-1 and Jeko-1/R cells

表1 西达本胺联合利妥昔单抗对Jeko-1和Jeko-1/R细胞增殖的影响（%）Tab.1 Effects of chidamide combined with rituximab on the proliferation of Jeko-1 and Jeko-1/R cells（%）

图3 西达本胺联合利妥昔单抗对Jeko-1和Jeko-1/R细胞增殖的影响Fig.3 Effect of chidamide combined with rituximab on the proliferation of Jeko-1 and Jeko-1/R cells

2.3 西达本胺对Jeko-1和Jeko-1/R细胞CD20 mRNA表达的影响

RT-PCR实验结果显示，西达本胺在48 h呈剂量依赖式上调Jeko-1/R细胞CD20 mRNA的表达，组间差异有统计学意义（F=346.123，P<0.001），多重比较显示，4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L 西达本胺作用时Jeko-1/R细胞CD20 mRNA的表达水平均高于0 μmol/L（均 P<0.01）。见图 4。

图4 西达本胺对Jeko-1和Jeko-1/R细胞CD20 mRNA表达的影响Fig.4 Effect of chidamide on the expression of CD20 mRNA in Jeko-1 and Jeko-1/R cells

2.4 西达本胺对Jeko-1/R细胞组蛋白H3、H4乙酰化水平的影响

Western blot实验结果显示，西达本胺在48 h可以剂量依赖式上调Jeko-1/R细胞的H3和H4的乙酰化水平，且组间差异有统计学意义（F=690.077，P<0.001；F=847.194，P<0.001），多重比较显示，4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L西达本胺作用时H3和H4的乙酰化水平均高于 0 μmol/L（均 P<0.01）。见图 5。

3 讨论

图5 西达本胺对Jeko-1/R细胞组蛋白H3、H4乙酰化水平的影响Fig.5 Effect of chidamide on the acetylation levels of histone H3 and H4 in Jeko-1/R cells

B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤最常见的类型，利妥昔单抗联合化疗是有效的治疗方案，但仍有部分患者不敏感，逆转利妥昔单抗耐药成为B细胞淋巴瘤临床治疗中亟待解决的问题之一。HDAC抑制剂作为新一代靶向抗肿瘤药物，在血液系统恶性肿瘤中显示了良好疗效［6-7］。其中 Vorinostat、Romidepsin、Panobinostat等HDAC抑制剂在国外已获批用于皮肤T细胞淋巴瘤治疗［8］。一项Ⅱ期临床试验结果显示利妥昔单抗联合Vorinostat能抑制惰性B细胞淋巴瘤疾病进展［9］。西达本胺也是一种新型的口服酰胺类HDAC抑制剂，可选择性抑制 HDAC1、2、3 和 10 的活性［10］。西达本胺还可以提高组蛋白H3、H4乙酰化水平，引发染色质重塑，并由此产生表观遗传改变，进而抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡。此外，西达本胺还具有诱导肿瘤干细胞分化、逆转肿瘤细胞的上皮间充质表型转化等功能，在恢复耐药肿瘤细胞对药物敏感性和抑制肿瘤转移、复发等方面发挥作用［11］。目前在肝癌、白血病以及膀胱癌中西达本胺也显示出一定疗效［12-14］。2015年西达本胺被批准用于复发/难治性外周T细胞淋巴瘤的治疗［10，15-16］。但HDAC抑制剂在B细胞淋巴瘤治疗中的价值仍不明确。为探索西达本胺在B细胞淋巴瘤耐药中的作用，本研究分别采用不同浓度利妥昔单抗和西达本胺处理B细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1和耐药细胞株Jeko-1/R，CCK-8实验结果发现，不同浓度利妥昔单抗和西达本胺在48 h时均呈剂量依赖式抑制Jeko-1细胞增殖，但对于耐药Jeko-1/R细胞，利妥昔单抗并未观察到明显的增殖抑制作用，提示Jeko-1/R对利妥昔单抗耐药；而西达本胺作用Jeko-1/R细胞却同样表现出剂量依赖式增殖抑制作用，且与Jeko-1细胞的增殖抑制率比较差异未见统计学意义，说明西达本胺对利妥昔单抗耐药细胞发挥了同效的增殖抑制作用，提示西达本胺可能成为B细胞淋巴瘤耐药患者的治疗选择。

利妥昔单抗是针对B细胞CD20抗原的一种人鼠嵌合性单克隆抗体，能特异性地与B细胞表面的CD20抗原结合，通过多种机制清除体内的B淋巴细胞。有研究发现CD20表达丢失可导致利妥昔单抗耐药，在利妥昔单抗治疗后复发的淋巴瘤患者及利妥昔单抗耐药患者中均发现CD20表达降低或丢失［17-22］；甚至部分初治患者也观察到CD20低表达，且与不良预后有关［19］，因此认为CD20低表达或缺失可能是导致利妥昔单抗治疗失败的原因。而关于CD20表达下调，有研究认为可能是由HDAC使组蛋白脱乙酰化所致，也有研究发现HDAC抑制剂可上调CD20表达，克服不同类型B细胞淋巴瘤患者先天性和获得性的利妥昔单抗耐药性，增强利妥昔单抗的细胞毒作用［3-4，21］。此外，去甲基化药物可恢复CD20 mRNA和蛋白表达，提示表观遗传机制有可能是利妥昔单抗治疗后CD20下调的基础。也有研究认为HDAC抑制剂联合利妥昔单抗可能具有协同作用，且与上调B淋巴瘤细胞 CD20表达有关［3，23-24］。以上研究结果提示联合应用HDAC抑制剂可能是克服利妥昔单抗耐药B细胞淋巴瘤的有效策略。本研究采用西达本胺联合利妥昔单抗分别处理Jeko-1细胞和耐药细胞株Jeko-1/R，结果发现与西达本胺单药相比，两者联合应用时耐药Jeko-1/R细胞增殖抑制率明显提高，且与非耐药Jeko-1细胞增殖抑制率相当，提示西达本胺能恢复Jeko-1/R细胞对利妥昔单抗的敏感性。进一步观察西达本胺对耐药Jeko-1/R细胞CD20 mRNA表达及组蛋白H3、H4乙酰化水平的影响，发现西达本胺以剂量依赖的方式上调Jeko-1/R细胞CD20 mRNA的表达，说明西达本胺可恢复耐药细胞对利妥昔单抗的敏感性，达到逆转耐药的目的，且可能是通过上调组蛋白H3、H4的乙酰化水平逆转耐药。

综上所述，本研究发现西达本胺可逆转利妥昔单抗耐药性，与利妥昔单抗联合应用可抑制利妥昔单抗耐药淋巴瘤细胞增殖，其作用机制可能与西达本胺上调利妥昔单抗耐药细胞组蛋白H3、H4乙酰化水平有关。两者联合用药为治疗复发/难治性B细胞淋巴瘤提供了新的思路。