桤叶唐棣外植体灭菌试验研究

黄立华

(辽宁省旱地农林研究所，辽宁 朝阳 122000)

桤叶唐棣(Amelanchieralnifolia)为蔷薇科唐棣属落叶小乔木或灌木，原产北美洲，在欧洲多国有栽培。果实为浆果，含有多种营养成分，鲜果含钙量高达0.88 g·kg-1，可鲜食可加工，主要用于酿酒、制造食品、果酱、药品和饮料。作为北美洲重要经济树种，是国际新兴的第三代水果典型代表。

辽宁省干旱地区造林研究所在我国最早种植桤叶唐棣，从加拿大引进，并在许多省(市、区)开展了区域试验和引种栽培研究，自此桤叶唐棣作为新型优良经济林树种在我国被重视。但优质适生种质资源少、扦插繁殖生根率低、无性繁殖难、后代变异严重、母本优良性状难保持等问题严重。为此我们进行了桤叶唐棣组织培养技术研究并获得成功，尤其在外植体消毒灭菌——无菌组织培养关键环节取得成功，筛选出了桤叶唐棣外植体消毒灭菌最佳方案，报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

6月采集的当年生桤叶唐棣健壮带腋芽茎段。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体材料清洗 将供试外植体带回准备室，剪掉叶片，在流水下用软毛刷冲洗、刷掉表面尘土，剪成带单芽的茎段，置于烧杯中，加入肥皂水浸洗，大约浸搅5 min，然后再用自来水冲洗净肥皂液，将烧杯口用纱布扎住，置自来水龙头下冲洗2～3 h备用。

1.2.2 外植体材料消毒灭菌 在超净工作台将外植体材料转放到消过毒的烧杯中，倒入75%酒精浸泡30 s，用无菌水冲洗2～3次，然后倒入已经配好的消毒溶液(表1)，用玻璃棒轻轻搅动，使外植体材料各部分与消毒溶液充分接触，达到彻底消毒效果。在快达到预定时间之前的1～2 min,把消毒溶液全部倒出，立即倒入无菌水，轻轻搅动涮洗。外植体材料消毒时间为倒入消毒溶液至倒入无菌水。无菌水涮洗每次3 min左右，涮洗3～8次，至消毒溶液涮洗干净为止。

表1 消毒溶液浓度消毒时间

1.2.3 外植体接种 在超净工作台，将冲洗干净、沥干水分的外植体按无菌操作要求，切成长约1 cm、具1～2个腋芽的茎段，插入固体培养基中培养。每瓶接种1个芽，每种处理接种50瓶。

1.2.4 培养基的配制 培养基配方：MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.08 mg·L-1+白糖35 mg·L-1+琼脂8 mg·L-1。pH值5.5～5.8。1.1 kg·cm-2,121 ℃灭菌20 min。

1.2.5 培养条件 培养室温度控制在(23±2) ℃，光照强度1 500～2 000 Lx，光照时间为14～16 h·d-1。

1.2.6 培养反应的观察与统计 培养3 d后，观察污染情况，将污染瓶清理出培养室；培养20 d后统计污染情况；培养30 d后统计污染率、褐化率与成活率。

2 结果与分析

2.1 HgCl不同消毒时间对外植体成活的影响

培养3 d后观察，HgCl消毒4 min茎段最早出现污染，以后其它消毒时间处理的茎段也陆续出现污染；培养7 d后，消毒10 min以上的茎段开始出现褐化，10 d后消毒8 min的茎段出现褐化，直至培养30 d后统计，灭菌6 min茎段只有1瓶褐化苗，灭菌4 min无褐化苗。从表2中可以看出，灭菌12 min褐化率最高，为56%，成活率最低，为14%；灭菌4 min，虽无褐化苗，但污染率高达100%；外植体成活率在灭菌10 mim时到达最高，为52%。

表2 HgCl不同消毒时间的外植体污染率、褐化率、成活率

HgCl消毒时间与外植体污染率、褐化率、成活率的关系是随着消毒时间的增加污染率降低，褐化率升高；成活率在消毒时间≤10 min时，随消毒时间延长而升高，消毒时间>10 min后又下降。

2.2 NaClO不同消毒时间对外植体成活率的影响

培养3 d后观察，NaClO消毒处理的茎段污染瓶数较多，培养15 d左右，灭菌10 min以下的茎段已全部被污染。从表3中可以看出，NaClO灭菌时间≤10 min，茎段污染率100%；灭菌时间>10 min，污染率稍降低，但同时褐化现象轻微发生，成活率仍较低；灭菌25 min时成活率最高，为8%。

表3 NaClO不同消毒时间的外植体污染率、褐化率、成活率

NaClO消毒时间与外植体污染率、褐化率、成活率的关系是，外植体污染率消毒时间在10 min以内为100%，随着消毒时间的增加，污染率逐渐降低，但始终保持在70%以上的较高水平；外植体褐化率消毒时间超过10 min后，随着消毒时间的增加而逐渐增加，消毒时间为30 mim时，褐化率达到最高；成活率在消毒时间≤8 min 时,随消毒时间延长而升高，消毒时间超过8min之后，又下降。

3 结论与讨论

试验结果为，外植体灭菌，消毒处理时间很关键，但灭菌剂的选择也至关重要。用5%NaClO灭菌消毒，消毒时间低于10 min，污染率100%，高于10 min,污染率略有下降，但褐化率随之增加，最高成活率仅为8%； 5%的NaClO消毒效果达不到实际应用的要求，不适合做桤叶唐棣外植体灭菌剂。用0.1%HgCl对桤叶唐棣外植体消毒10 min，污染率32%，褐化率16%，成活率52%；0.1%HgCl消毒10 min是桤叶唐棣外植体比较理想的灭菌消毒方法。表明只要达到足够消毒时间，较低浓度的HgCl也能达到有效灭菌效果，建立桤叶唐棣无菌繁殖体系。

进行外植体消毒灭菌，方可保证无菌组织培养的进行。在对外植体消毒灭菌，确定消毒剂种类、消毒浓度、消毒时间，要考虑外植体不同取材部位、取材季节、取材大小，其带菌程度不同，对不同种类、不同浓度的消毒剂的敏感度也不一样，选择的灭菌方案既要消灭材料上的病菌，同时又不损伤或只轻微损伤组织材料而不影响其生长。操作过程中，仔细理解并牢固建立“无菌”思想，时时处处严格执行无菌操作要求。只要做到这些，就可建立无菌繁殖体系。