刺五加组织培养快繁技术研究

刘国丽,龚 娜,杨 光

（辽宁省农业科学院，沈阳 110866）

刺 五 加[Acanthopanax senticosus（Rupr.rt Maxim.）Harms]属于五加科（Araliaceae）五加属（Acanthopanax），又称五加参、老虎镣子、刺拐棒[1]。主要分布在我国黑龙江、吉林、辽宁、河北、陕西等省及俄罗斯、朝鲜、韩国、日本诸国[2]。作为一种新型水果，刺五加果实富含多种活性物质，具有抗疲劳、改善睡眠等功效[3～5]，为珍稀保健食品，具有较好的经济价值和药用价值。现已利用刺五加浆果开发出风味独特、具有保健功能的刺五加果酒、果醋、果汁饮料、果糕等食品。

随着刺五加相关商品不断被开发，人们对刺五加的需求量日益增加，对野生刺五加采挖强度不断加大，甚至挖断野生刺五加根系。这种无限制地自由采挖，加上刺五加自身繁殖能力低，导致刺五加野生资源的严重破坏，产量大幅削减[6]。因此，探索刺五加种苗繁育技术，提高刺五加栽培水平，加大人工保护和培育是实现刺五加产业可持续利用的必然之路。本研究以刺五加的分蘖芽为外植体，开展不同消毒方法及不同激素浓度组合对芽诱导和增殖影响的研究，以期为刺五加快繁体系的建立和开发利用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018年在辽宁省农科院省重点实验室进行。供试材料为野生、健壮、无病虫害且带有完整饱满越冬芽的刺五加根颈。洗净根部的泥土，将枝条切割成2～3 cm 的小段，置于饱和洗衣粉溶液浸泡10 min，流水冲洗2～3 h，再用无菌水冲洗3 遍，置于超净台备用。

1.2 试验设计

1.2.1 外植体消毒时间试验

选取刺五加的分蘖芽作为外植体，以75%乙醇浸泡消毒30 s，无菌水冲洗3 遍，再用0.1%升汞分别消毒处理3、5、7、10 min；消毒后用无菌水冲洗5 次，吸干表面的水分；用无菌手术刀剥去芽保护层，接种于培养基，置于培养室培养。设置温度为22 ℃，光照强度为1 500 lx，光照时间为12 h/d。每个处理接种10 瓶，每瓶3 个外植体。定期观察统计外植体污染率、存活率、死亡率、萌发及生长状况。

死亡率（%）=（接种的外植体总数-污染的外植体数-存活的外植体数）/接种的外植体总数×100

1.2.2 芽诱导培养的激素组合筛选试验

MS 培养基，分别添加不同浓度的6-BA 和NAA（表1），接入外植体，对其进行不定芽诱导。每个培养基接种10 瓶，每瓶接2 个外植体，重复3 次。定期观察不同激素浓度组合因素对芽形成的影响。

诱导率（%）=产生不定芽的外植体数/存活的外植体数×100

表1 芽诱导培养基不同激素浓度组合

1.2.3 增殖培养的激素组合筛选试验

采用MS 培养基，分别添加不同浓度的6-BA 和IBA（表2），接入诱导出的丛生芽。每个处理10 瓶，每瓶2 个外植体，重复3 次。

增殖倍数=萌发出丛生芽的总数/（接种的外植体总数-污染的外植体数）

表2 外植体继代增殖培养基不同激素浓度组合

1.3 数据分析

数据计算在Microsoft Excel 2007 中进行，方差分析采用Duncan's 新复极差检验法进行数据方差分析，在SPSS19.0 中完成。

2 结果与分析

2.1 刺五加外植体消毒的最佳时间

外植体的消毒处理非常重要，直接决定组织培养的成功与否[7]。外植体上附着各种杂菌，若消毒时间过短，外植体杂菌未被完全杀死，污染率高，外植体存活率低；消毒时间过长，外植体受到伤害严重，难以萌发。接种35 d 后，进行数据统计（表3），不同升汞消毒时间对刺五加外植体污染率、存活率及死亡率的影响显著。随着消毒时间的延长，污染率逐渐降低，死亡率升高。升汞消毒7 min 消毒效果较好，污染率较低（11.11%），存活率最高（81.11%）；升汞消毒10 min 外植体虽然污染率最低（3.33%），但是芽褐变严重，芽的存活率比消毒7 min 低。

表3 不同消毒方法对刺五加外植体的影响

2.2 刺五加芽诱导培养的适宜激素组合

激素具有调节植物生长和刺激细胞分裂作用，添加激素种类和浓度是芽诱导和增殖的关键影响因素。接种35 d后进行数据统计（表4），6-BA和NAA不同浓度组合对刺五加芽诱导率影响显著。6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1组合处理的芽诱导率最高 （85.56%）。其 次 为6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1处 理 的（82.22%）。此外，当NAA 浓度一定时，6-BA 浓度与芽诱导率有一定正相关。当6-BA 浓度为0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1时，NAA 浓度增加芽诱导率也随之增加；当6-BA 浓度为1.5 mg·L-1时，NAA 浓度为0.8 mg·L-1的芽诱导率低于NAA 0.5 mg·L-1和0.3 mg·L-1处理的。

表4 不同激素浓度组合对刺五加外植体芽诱导率的影响

2.3 刺五加增殖培养的适宜激素组合

把诱导出的丛生芽转入增殖培养基进行继代培养。由表5可见，不同浓度激素组合对外植体继代增殖的影响很大。其中MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1，增殖倍数最大（3.4 倍），且苗叶片大，生长健壮。其次为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.25 mg·L-1，增殖倍数次之（3.13 倍）。此外，当6-BA 浓度一定时，IBA 浓度增加，增殖倍数也随之增大。

表5 不同激素组合对外植体继代增殖的影响

3 结论

外植体木质化程度不同、携带杂菌等都会影响消毒的效果，因此合适的外植体与最佳消毒方法非常重要，是组织培养成功的关键。本研究以刺五加的分蘖芽为外植体，用75%乙醇消毒30 s 后，采用0.1%升汞消毒7 min 的，外植体污染率低，存活率高（ 81.11%）。刺五加芽诱导培养的最佳激素组合为6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，芽诱导率最高（85.56%）；增值培养的最佳激素组合为6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1，芽增殖倍数最高（3.4 倍），丛生芽生长势好，健壮。