新冠疫情下医学免疫学居家实验教学探索与实践①

杨 敬 徐 勇 朱慧芬 林传友 欧阳兴飚 杨真荣 宗义强 吴雄文 郑 芳 梁智辉

(华中科技大学同济医学院基础医学院，华中科技大学基础医学国家级实验教学示范中心，武汉 430030)

2019年末，我国突发新冠肺炎疫情，为防止疫情在校园蔓延，教育部下发了延迟2020年春季开学的通知，并发布了关于在疫情防控期间做好普通高等学校在线教学组织与管理工作的指导意见，要求各高校通过多种方式保证疫情防控期间教学进度和教学质量[1]，为此，医学免疫学实验课也打破了传统的教学方式，迎来了新的机遇和挑战。

实验教学是医学课程体系的重要组成部分，是连接基础医学和临床医学的桥梁[2]，疫情防控期间，为响应教育部“停课不停教、停课不停学”的号召[3]，全国各高等院校均开展了理论课网上直播教学、实验课虚拟实验教学等在线教学模式，并取得显著成效。但虚拟实验也存在不足，在虚拟环境下，学生处于被动模拟状态，不能锻炼实际动手能力，没有在实践中发现问题、分析问题和解决问题的机会，不利于学生的全面发展，只有虚实相结合，方能保障“教学标准不降低，教学质量不打折”的实验教学效果。

为弥补虚拟实验的不足，我中心教师团队，积极深化课堂教学改革，深入贯彻落实习近平总书记“坚决打赢疫情防控的人民战争、总体战、阻击战”的重要指示精神，不忘初心，砥砺前行，结合医学免疫学实验特点，制定并开展了疫情期间系列居家实验教学项目，全部实验环节由学生在家里完成，培养了学生的科学精神、创新意识和实践能力[4]，保障了特殊时期实验教学工作的顺利开展。

1 医学免疫学居家实验教学方案

采用“PIELS”(preview-interaction-experiment-labreport-summary)居家实验教学模式，充分发挥学生主体作用，探索医学免疫学居家实验教学综合改革和创新性人才培养模式。具体方案见图1。

2 医学免疫学居家实验教学准备

2.1居家实验可行性选择 我校本科生免疫学实验课根据专业和课时不同分为4～8次课，本学期有4次实验课，分别是凝集与沉淀反应，ELISA，免疫器官识别与T细胞凋亡检测，淋巴细胞分离与NK细胞活性检测。其中“双向琼脂糖凝胶免疫扩散实验”和“ELISA实验”操作相对简便，不受动物、细胞和仪器等实验条件限制，且可通过目测法观察到实验结果，因此，本团队选择这两项实验作为居家实验的首次探索和实践内容。

2.2居家实验条件摸索 由于同学们散居在全国各地、天南地北，实施居家实验模式需要将实验试剂与实验材料打包通过快递的方式邮寄至学生家中。湖北及其周边地区顺丰快递可1～2 d内到达，其他地区一般需要3～4 d，少数地区如新疆则需更长时间。抗原与抗体是“双向琼脂糖凝胶免疫扩散实验”和“ELISA实验”中重要试剂，能否经过高温与长途运输后仍保持较高活性是决定居家实验能否成功的关键因素，为此我们对实验试剂的有效性、稳定性与实验可行性进行了探索与优化。

2.2.1双向琼脂糖凝胶免疫扩散实验 “沉淀反应”是检测抗原抗体反应的实验内容， 为保障居家实验的可行性，我们对沉淀反应中“双向琼脂糖凝胶免疫扩散实验”条件进行了改进。① 琼脂糖浓度的调整：由于1.0%的琼脂糖凝胶较软，不利于学生打孔，我们将居家实验所用琼脂糖溶液浓度调整为1.5% 。② 琼脂糖溶液的准备：考虑到学生在家中不方便称重，我们先将1.5%的琼脂糖盐水配好，再分装至50 ml离心管中凝固寄出，学生在家中取约15 ml凝胶移入50 ml玻璃烧杯中，微波炉低火加热1～2 min或隔水煮至液体透明即可。③ 抗原、抗体使用浓度：我们在预实验中将抗原、抗体先放置室温72 h(武汉，阴雨天气25～32℃)，以模拟邮寄途中温度，结果显示，抗原、抗体维持原浓度常温放置数天后再进行实验也可得到较好的实验结果。

图1 基于PIELS教学模式的医学免疫学居家实验课Fig.1 Experimental class of Medical Immunology at home based on PIELS teaching mode

2.2.2ELISA ELISA是通过抗原-抗体的特异性反应，应用免疫酶技术定量检测可溶性抗原的常用方法之一，在多数医学院校免疫学实验课中均有开设。为保障居家实验的可行性，我们对其在常温状态下的实验条件进行了摸索、改进与优化。首先，将所有试剂均置于武汉常温状态下(武汉，阴雨天气25～32℃)，72 h后再进行全室温状态下的ELISA实验。实验结果表明：全常温状态下居家实验包中所有实验试剂均能保持较高活性，标准曲线相关性好，与实验室非常温状态下(抗原、抗体稀释后4℃保存)几乎一致(图2)。此外，需要注意各实验试剂的分装与保存方式略有不同：酶标记羊抗人IgG抗体因叠氮钠影响其酶活性，故不能添加叠氮钠进行防腐，需要无菌分装；其他试剂均可按1∶1 000比例加入的叠氮钠保存液，以防细菌生长而影响实验结果；包被、封闭缓冲液无需添加叠氮钠可在普通环境下分装。

2.3居家实验包准备生理盐水(1 ml/支，1支)；② ELISA实验：包内试剂可满足2次实验需要,包被缓冲液(pH9.6 0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液，1.35 ml/支，2支)；羊抗人IgG抗体(按1∶10稀释，180 μl，2支，包被时再次按1∶10稀释)；封闭液(pH9.6 0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，6 ml/支，1支)；牛血清白蛋白(BSA，120 mg/支，实验前用3 ml封闭液配制成4% BSA封闭液，2支)；标准品人IgG(12 μg/ml,150 μl，2支)；待检样本(按一定比例稀释的人IgG，150 μl，2支)；阴性对照(6 μg/ml BSA溶液，150 μl，2支) ；稀释液(pH7.4 0.01 mol/L PBS，1.5 ml/支，2支)；辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(HRP-Ab，二抗，1∶2 000稀释，1.5 ml/支，2支)；洗涤液(PBS-T，含0.1%吐温-20，pH7.4 0.01 mol/L PBS，50 ml/支,1支) ；底物溶液(TMB溶液，1.5 ml/支，2支)。

2.3.1试剂分装 ①双向琼脂糖凝胶免疫扩散实验：琼脂糖凝胶(1.5%琼脂糖溶液经微波炉加热溶解后， 取30 ml至50 ml塑料管中冷却，1管)；10 mg/ml 人IgG(50 μl/支，1支)；羊抗人IgG(出厂效价1∶32，实验时按1∶2稀释，60 μl/支，1支)；0.9%

图2 全常温与实验室非常温保存状态下，ELISA实验标准曲线Fig.2 Standard curve of ELISA experiment under room or low temperature

2.3.2包装、运输 ①将“双向琼脂糖凝胶免疫扩散实验”分装试剂和下列实验材料一起放入A密实袋中，封好袋口。实验材料：打孔器(1个)、打孔模板(1张)、针头(1个)、载玻片(3片)、50 ml玻璃烧杯(1个)、一次性滴管(2支)、Tip吸头(若干)、酶标条(稀释样本用，2条)。②将“ELISA实验”分装试剂和下列实验材料一起放入B密实袋中，封好袋口。实验材料：酶标反应条(3条)、一次性吸管(3支)、一次性试管(1支，备用)、Tip吸头(若干)。③10～100 μl量程加样器1支、乳胶手套和纸质版居家实验操作流程及须知。④将以上实验物品一起放入居家实验包中，用泡沫或硬纸板塞满塑料盒以防震荡，顺丰快递邮寄到学生家中。

3 医学免疫学居家实验教学实践

3.1实验步骤

3.1.1双向琼脂糖凝胶免疫扩散实验(参考实验教材[5]) ①溶胶：取出50 ml离心管中的琼脂糖凝胶块约15 ml置于50 ml玻璃烧杯中，微波炉低火1～2 min，或将装有凝胶块的烧杯放入水锅中加热，直至凝胶融化为透明液体。②琼脂板的制备：将载玻片置于水平台面上，用吸管吸取加热的1.5%琼脂糖溶液4 ml，均匀地浇注在载玻片上。③打孔：待琼脂糖溶液凝固形成琼脂板后，置于纸质模板上，用打孔器打出一个中央孔，6个周围孔，针头挑出孔内琼脂糖凝胶块。④加样：用加样器加入10 μl羊抗人IgG抗体于中央孔，周围孔1～5分别加入1∶2～1∶32 稀释的人IgG抗原10 μl，周围孔6加入生理盐水作为阴性对照。⑤反应：将琼脂板放入湿盒内，常温24 h后观测结果。

3.1.2ELISA实验(参考实验技术[6]) ① 包被：取150 μl羊抗人IgG加入到包被缓冲液中(1∶10稀释)，盖上EP管盖，颠倒混匀后加入酶标条孔中，100 μl/孔，置湿盒：室温过夜。②封闭液配制(4% BSA溶液)：取1支一次性试管，并将BSA粉剂倒入试管中，吸取3 ml封闭液溶解，一次性吸管反复吹打混匀使其溶解，备用。③封闭：弃去包被液，吸水，纸上甩干液体，然后加入上述封闭液，200 μl/孔，置湿盒，室温2 h。④洗涤：加入洗涤液200 μl/孔，室温放置3 min倾去，反复3次。⑤加样：前9孔加入100 μl稀释液，按图3将已知含量的参考蛋白IgG进行倍比稀释，第10孔加待检样本， 第11孔加阴性对照，第12孔加入稀释液作空白对照(各100 μl/孔)，置湿盒，室温，孵育80 min。⑥洗涤：步骤同④。⑦加酶标记的抗人IgG抗体(即二抗)(100 μl/孔)。⑧孵育：置湿盒，室温，60 min。⑨洗涤：步骤同④。⑩显色：加TMB底物溶液，100 μl/孔 ，室温避光5～15 min或待标准系列各孔呈明显的颜色深浅梯度时拍照留存并肉眼判断待测结果。

3.2实验结果 图4为学生居家所拍实图。“双向琼脂糖凝胶免疫扩散实验”结果见图4A，周围孔1∶2～1∶16与中央孔间出现清晰的白色沉淀线，抗原含量越高，沉淀线越粗，与中央孔的距离越近，1∶32和阴性对照与中央孔无沉淀线；“ELISA实验”结果见图4B，1～9孔标准品，随着稀释浓度的降低，颜色逐渐变浅，目测观察，第10孔待测样品与标准品第5孔颜色相当，阴性对照和空白对照无色。

3.3居家实验调查统计 以本校2017级中德班、2018级英护、法医、中西医、口腔和医学检验班学生为居家实验对象，共141人，发放问卷141份，截止7月30日共回收问卷125份。①实验结果统计：“双向琼脂糖凝胶免疫扩散实验”待测抗原稀释度在预估区的学生人数为108人(占回收问卷人数86.4%)，偏离预估区1个稀释度以上的学生人数为17人，(占回收问卷人数13.6%)；“ELISA”待测样本稀释度在预估区的学生人数为110人，(占回收问卷人数88.0%)，偏离预估区2个稀释度以上的学生人数为15人，(占回收问卷人数12.0%)，说明多数同学居家实验结果较好。②居家实验体验感：96人(占回收问卷人数76.8%)认为该居家实验操作性强，安全性高，总体安排和设计很满意，实验有收获；29人(占回收问卷人数23.2%)感觉居家实验不便，个人操作容易失误或试剂漏损等因素导致体验感差，说明少数学生对居家实验感到不适，我们的居家实验教学工作有待进一步提高。

图3 抗原标准品的倍比稀释与样品孔设置Fig.3 Multiple proportions dilution of standard antigen and the wells of sample

图4 学生居家实验结果Fig.4 Experiment results done by student at home

3.4居家实验中出现的小问题与解决方法 虽然教师已尽量针对实验中可能出现的问题提前进行了解决，但实际操作过程中仍出现了些许小问题，通过与老师在线交流、分析失误原因，同学们采用改进方法、重配试剂等手段自主解决了以下问题。

3.4.1双向琼脂糖凝胶免疫扩散实验 ①煮沸凝胶方法操作不当，导致水分挥发，胶量不足。解决方法：取胶时应尽量捣碎凝胶块，并适量加入纯净水(约5 ml)，在锅中融胶时需不断搅拌，以便充分溶解。②实验结果无沉淀线，查找原因：加样时抗原抗体加反导致。解决方法：认真阅读操作说明，重新再做。③EP管中的实验抗原、抗体量较微量，运输过程中试剂会沾到管壁上，学生误认为试剂遗漏。解决方法：用力甩几下EP管，让试剂下沉。

3.4.2ELISA实验 ①抗人IgG抗体遗漏。解决方法：两次实验试剂合并为一次；可以采用双扩抗体，按比例稀释。②空白管、阴性实验管有较深颜色，浓度梯度不好。解决方法：认真阅读操作说明和观看操作视频，查找原因，重新再做。

疫情期间，给医学免疫学实验教学带来巨大挑战，在师生异地条件下，虽不能像往常一样在实验室正常进行授课，但利用丰富的网络资源和线上交流平台以及方便的物流让学生在家中也可以做实验。与传统教学模式和虚拟仿真实验教学相比较[7，8]，PIELS居家实验教学模式，充分尊重学生个性化发展，学生可通过课前预习、师生线上互动、独立实验、实验报告、调查问卷和教师点评等环节，巩固理论知识，提高居家独立实验操作技能，加深对基本概念和原理的理解，激发探索科学的好奇心，实现学生的全面发展；教师通过建立微信“家庭实验讨论群”对学生在实验操作中遇到的各种问题进行远程辅导和答疑，在拓展学生知识的同时，了解学生居家实验难点，鼓励学生自主解决实际操作问题，改进实验方法，形成以学生为主体的实验教学模式。我们通过系列居家实验项目的首次探索，积累了一定的实验教学经验，保障了实验教学进度和教学质量，得到学生们的认可，为重大疫情和灾难下构建居家实验教学新模式奠定了基础，也为校内开展自助式实验实践训练摸索了条件，值得各大高校推广和应用。