肉桂精油乳液的制备及抑菌性

汪师帅，朱 蝶

（武汉商学院 食品科技学院，湖北 武汉430056）

肉桂精油是从桂皮、桂叶、桂枝等部位提取而得，为琥珀色液体，香气强烈持久。肉桂醛是肉桂精油的主要成分，难溶于水和甘油，易溶于醇和醚类物质，能随水蒸气挥发，导致肉桂精油在食品中很难稳定存在[1]。肉桂醛也易发生化学降解，导致香味丢失，并产生异味，在一定程度上限制了应用[2]。

肉桂醛的抑菌性良好，对细菌、真菌等微生物具有较强的抑制作用。肉桂醛能够使细菌的细胞膜破裂，使细菌在细胞分裂时产生畸变和异常分裂，从而对细菌的正常生长繁殖产生直接的抑制作用，导致其外观形态发生明显变化。此外，肉桂醛还能与细菌DNA发生相互作用，影响细菌DNA的正常合成，并能够改变细菌内部的离子平衡，导致细菌发生解体而死亡[3]。

作者通过将肉桂精油制备成水包油型乳液，一方面探讨了该乳液对离心转速、温度以及储藏时间的稳定性；另一方面通过改变乳液中肉桂精油的质量分数，获得一系列不同粒径分布的乳液液滴。在此基础上，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对象，探讨乳液的粒径大小与其抑菌效果的相关性。本研究可为肉桂精油在食品加工中的有效应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肉桂精油：深圳市鼎诚植物香料有限公司产品；中链脂肪酸（MCT，食品级）：武汉博星化工有限公司产品；吐温80、司班20（分析纯）：上海申宇医药化工有限公司产品；营养肉汤培养基（LB培养基，含有胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L）：上海博微生物科技有限公司产品。

大肠杆菌（Escherichia coli）与金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）来源于中国医学菌种保藏中心。

1.2 仪器

DF-101Z集热式恒温加热磁力搅拌器：郑州长城科工贸有限公司产品；CJJ78-1电子天平：上海越平科学仪器有限公司产品；Zetasizer nano ZS纳米粒度分析仪：英国马尔文仪器公司产品；TG16-WS高速冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司产品；JY92-IIN紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司产品；YXQ-50SII压力蒸汽灭菌锅：上海博迅有限公司产品；HCY-123C恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司产品。

1.3 肉桂精油乳液的制备

称取一定量的肉桂精油与MCT混合均匀，逐滴加入含有乳化剂的水中。整个实验在50℃水浴条件下进行，持续15 min。在乳液体系中，固定油相总体质量分数为5%，乳化剂（司班20∶吐温80=1∶3，质量比）质量分数为10%，水的质量分数为85%。为了得到不同粒径的乳液，可通过改变肉桂精油的添加量，使肉桂精油占整个乳液体系的质量分数分别为0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%。

1.4 乳液的粒径及PDI测定

采用纳米粒度仪Zetasizer nano ZS测定肉桂精油乳液的平均粒径及多分散系数PDI值，参数设置为温度25℃，散射角173°，折射率1.453。为降低多重光散射效应，测定前需用去离子水稀释溶液。实验重复测定3次取平均值，采用d4，3即体积平均粒径表征乳液粒径的大小。

1.5 肉桂精油乳液的稳定性测定

离心稳定性：将质量分数1.5%肉桂精油乳液于2 000～12 000 r/min的条件下离心12 min，观察乳液是否分层。若无分层，测定其粒径及PDI大小。每个样品设置3个平行。

热稳定性：将质量分数1.5%肉桂精油乳液分别放置在4、25、40、60、80℃的条件下处理30 min，测定其粒径及PDI大小。每个样品重复测定3次。

储藏稳定性：将肉桂精油乳液放置于4℃和25℃条件下储藏不同时间。每隔一段时间取样，测定其粒径及PDI大小。每个样品重复测定3次。

1.6 乳液的抑菌性测定

乳液的处理：以无菌水为空白对照，实验组为T-0.5%、T-1.5%、T-2.5%，分别对应乳液中肉桂精油的质量分数为0.5%、1.5%、2.5%。为了保证乳液中肉桂精油的质量相同，用无菌水将T-1.5%、T-2.5%分别稀释3倍和5倍，独立探讨不同粒径的乳液对细菌生长的抑制情况。

菌悬液的制备：用接种环从肉汤琼脂斜面上挑取一环活化后的受试菌至LB培养基中，37℃培养18～24 h得菌悬液。

动态抑菌曲线的制作：用移液枪准确吸取200μL菌悬液于离心管中，再加入1 800μL乳液或无菌水，混匀，静置0.5 h后放置于37℃培养。每隔一定的时间取样，测定样品在600 nm处的吸光度。每个样品设置3个平行。

1.7 数据处理

所有实验数据采用Origin 8.5软件进行平均值和方差分析。

2 结果与分析

2.1 肉桂精油质量分数对乳液粒径及PDI的影响

肉桂精油质量分数对乳液粒径及PDI值的影响，如图1所示。当肉桂精油质量分数从0.5%增大至2.0%，乳液粒径迅速从约50 nm上升至270 nm。随着精油质量分数进一步增加至2.5%，乳液粒径增加缓慢。PDI值是反应乳液均一性的重要指标。PDI值越小，乳液体系均一越好[4]。图中PDI值先减小后增大，在肉桂精油质量分数为1.5%时，PDI值达到最小，约为0.1。肉眼观察发现当精油质量分数＜1%，乳液澄清透明，泛微蓝色乳光。当精油质量分数≥1%，乳液呈现均一的乳白色。乳液外观的差异是乳液液滴与光线作用的结果。当液滴直径远大于入射光波长时，主要发生光的反射，伴随光的折射、吸收和散射，呈现乳白色、不透明的外观；当液滴直径稍大于入射光波长时，则有光的散射现象发生，体系呈半透明状；当液滴直径小于入射光波长时，光可完全透过，此时乳状液呈透明状。因此，可从乳液外观粗略判断乳液粒径大小[5]。

图1 肉桂精油质量分数对乳液粒径及PDI值的影响Fig.1 Effect of cinnamon oil concentration on particlesize and PDI value of emulsion

2.2 肉桂精油乳液的离心稳定性

稳定性是评价乳液质量非常重要的指标，也决定了乳液的储藏条件、应用范围及有效期限[6]。如若乳液体系的稳定性差，在储藏过程中会发生乳液液滴聚集，出现絮凝分层现象。该现象出现的快慢可评判乳液稳定性的差异。此部分通过离心这一物理方式可加速这一变化，来表征乳液的稳定性。

实验中控制乳液中各组分的质量分数分别为肉桂精油1.5%，MCT 3.5%，乳化剂10%，水85%，制备得到乳液，比较乳液经离心处理后粒径及PDI值的变化，结果如图2所示。经过不同转速（2 000～12 000 r/min）处理后，乳液的粒径基本维持在130 nm附近。离心转速的差异并不会导致乳液的粒径发生明显变化。然而，乳液PDI值随着离心转速增加而略微上升，说明高离心转速会导致乳液的均一性稍有下降。此外，通过肉眼观察发现乳液经不同转速离心后，均未出现絮凝分层现象。由此可见该乳液具有较好的离心稳定性，体系稳定性较好。

图2 离心转速对乳液粒径及PDI值的影响Fig.2 Effect of centrifugal speed on particle size and PDI value of emulsion

2.3 肉桂精油乳液的热稳定性

为了探究此肉桂精油乳液在应用及储藏时的温度条件，此部分实验将肉桂精油质量分数为1.5%的乳液放置于不同温度条件（4～80℃）下处理30 min，来判断乳液对热的稳定性。从图3可见，当温度低于40℃，乳液的粒径及PDI值基本不发生变化，粒径维持在130 nm，PDI维持在0.1。而在60、80℃条件下，乳液的粒径及PDI值陡然增加。表明高温会破坏乳液体系的稳定性。林丽萍等[7]利用司班和吐温系列乳化剂所制备的肉桂醛乳液在（54±1）℃条件下，贮存14 d后，出现了油析和白色沉淀。

图3 温度对乳液粒径及PDI值的影响Fig.3 Effect of temperature on particle size and PDI value of emulsion

此外，通过肉眼观察还发现乳液经过80℃处理后发生明显的分层现象。待此样品冷却，摇晃，样品又恢复均一的乳白色。司班20和吐温80属非离子型乳化剂，当温度较高时，乳化剂在水中的溶解度迅速降低而析出，体系发生分层现象。该现象称为起昙，温度为昙点。当环境温度低于昙点时，体系恢复澄清[8]。

2.4 肉桂精油乳液的储藏稳定性

为了探究此肉桂精油乳液的有效使用期限，此部分实验将不同质量分数的肉桂精油乳液置于4、25℃恒温条件下储藏不同时间，以乳液的粒径为主要评价指标，考察乳液的储藏稳定性，结果如图4所示。在4℃条件下，储藏1～5 d，各质量分数的肉桂精油乳液均能保持稳定，乳液粒径基本维持不变。在储藏第10天，各组乳液粒径均会发生不同程度地增加。高质量分数的肉桂精油（2.5%），乳液粒径从第7天开始增加。相比于4℃条件下所得结果，乳液在25℃条件下储藏稳定性可延长至10 d。如图4（b）所示，在储藏第10天，各质量分数精油的乳液粒径开始略微增加。由此可见，25℃更有利于该肉桂精油乳液的储藏。分析原因为精油在低温条件下易发生结晶，破坏乳液的界面膜，导致乳液颗粒的尺寸变大，均一性变差。此外，低温环境会降低乳液体系的热能，发生液滴少量聚集，亦不利于乳液的稳定性[9]。

图4 储藏时间对不同质量分数的肉桂精油乳液粒径的影响Fig.4 Effect of storage time on particle size of emulsion with different cinnamon oil concentrations

2.5 肉桂精油乳液对大肠杆菌的抑制作用

为了探讨肉桂精油乳液的抑菌效果，选择上述制备的3种精油乳液T-0.5%、T-1.5%、T-2.5%，分别对应乳液中肉桂精油的质量分数为0.5%、1.5%、2.5%，乳液液滴大小为50、150、280 nm（见图1）。用无菌水将T-1.5%、T-2.5%分别稀释3倍和5倍，以保证乳液中肉桂精油质量分数相同，独立探讨乳液粒径和抑菌情况的相关性。肉桂精油乳液对大肠杆菌的抑制情况，如图5所示。未添加肉桂精油乳液的空白组中，吸光度随着培养时间的延长一直增大。从生长曲线来看，大肠杆菌生长并未经历调整期，而直接呈指数式增长，生长良好。与空白组相比，乳液组的吸光度则持续下降，仅仅在培养初期0～1 h，乳液组的吸光度大于空白组，这是少量乳白色的乳液对光的散射所致。含有肉桂精油的乳液组均表现出良好的抑菌性能[10-11]，且T-1.5%组抑制效果最佳。由此可见，肉桂精油乳液粒径的不同会对大肠杆菌的动态抑菌曲线产生差异，在乳液粒径为150 nm时抑菌效果达到最好。王婧等[12]发现采用吐温80所制备的氯代肉桂醛纳米乳，平均粒径为15.88 nm，抑菌活性提高了50%～200%。

图5 肉桂精油乳液对大肠杆菌的抑制效果Fig.5 Inhibitory effect of cinnamon oil emulsion on Escherichia coli

2.6 肉桂精油乳液对金黄色葡萄球菌的抑制作用

肉桂精油乳液对金黄色葡萄球菌的抑制效果见图6所示。空白组中金黄色葡萄球菌经过约15 h的调整期后，开始迅速增长，生长状态良好。而乳液组在整个培养时间内（0～22 h），吸光度几乎维持不变，且在5 h后，吸光度明显低于空白组。表明金黄色葡萄球菌在肉桂精油乳液的作用下完全无法生长。对比乳液组发现，T-1.5%的抑制作用最强，T-0.5%和T-2.5%的抑制作用相差不大。要达到对金黄色葡萄球菌最好的抑菌效果，乳液的粒径为150 nm。对比图5和图6可得，肉桂精油乳液对大肠杆菌的抑制效果要优于金黄色葡萄球菌。分析原因为金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，细胞壁厚；大肠杆菌为革兰氏阴性菌，细胞壁薄。细胞壁组成结构的不同引起了抑菌效果的差异[13]。肉桂精油可通过破坏微生物的细胞壁、细胞膜，损伤DNA而发挥抑菌作用[14-15]。

图6 肉桂精油乳液对金黄色葡萄球菌的抑制情况Fig.6 Inhibition of Staphylococcus aureus by cinnamon oil emulsion

3 结语

作者首先通过改变肉桂精油的添加量（质量分数）0%～2.5%，利用司班20和吐温80为复合乳化剂，制备出粒度范围在50～280 nm的乳液。随后探讨了离心转速、温度、储藏时间对肉桂精油乳液稳定性的影响。乳液经2 000～12 000 r/min离心处理，粒径维持不变，稳定性较好。在高温条件下（60、80℃），乳液粒径显著增大，且出现分层现象，而在温度低于40℃时，稳定性较好。相比于4℃，乳液更适于在25℃条件下储藏，储藏10 d以内，乳液的粒径维持不变。最后，通过比浊法探讨乳液的粒径与抑菌性质的相关性。结果发现，当乳液粒径为150 nm时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果最好。本研究中通过乳化法提高了肉桂精油的稳定性，并探讨了乳液的抑菌性，可为后期在具体食品体系中的防腐杀菌应用奠定基础。