赤霞珠葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中香气成分动态变化

代晨曦， 张 旺， 张丹丹， 刘战霞， 程卫东， 王 斌， 史学伟

（石河子大学 食品学院，新疆维吾尔自治区 石河子 832000）

苹果酸-乳酸发酵 （malolactic fermentation，MLF）是葡萄酒乙醇发酵结束后的二次发酵，指乙醇发酵结束后的葡萄酒在乳酸细菌的作用下将葡萄酒中的苹果酸转化成乳酸和CO2的过程，也是葡萄酒酿造过程中最难以控制的过程，对酿造优质红葡萄酒具有重要作用[1]。 这个过程增加了葡萄酒风味的复杂性，对风味具有修饰作用[2-3]，其次级代谢提高了葡萄酒中的醛类、酯类、氨基酸等化合物的含量，从而改善葡萄酒的果香、花香等挥发性香气[4-5]。对于葡萄酒香气物质的测定，目前固相微萃取结合气质联用（HS-SPME-GC-MS）技术被广泛应用，给葡萄酒香气物质的分析鉴定提供有力的支撑[6]。 相比传统的分析方法，它具有高灵敏度、操作简单以及高重现性和用时短等优点[7]。 刘迪[8]等使用固相微萃取结合气质联用技术研究了干白葡萄酒瓶储过程中的香气物质动态变化，结果表明，干白葡萄酒随着瓶储的进行，香气物质呈现3 种不同的变化趋势，以酯类、醇类和萜烯类物质质量分数下降为特征。

然而，目前有关苹乳发酵过程中葡萄酒香气变化的研究不多，不同发酵时期对具体发酵香气成分和品种香气成分的影响缺乏数据。 研究了苹乳酸发酵过程中不同时期干红葡萄酒样品，通过顶空固相微萃取结合气质联用技术对红葡萄酒感官香气特征和香气成分进行量化分析，总结苹乳发酵各时期的香气成分和香气特征的变化规律，为红葡萄酒酿造的优化设计提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙醇发酵结束的赤霞珠干红葡萄酒：产地为新疆张裕巴保男爵酒庄，常规理化指标见表1。葡萄酒样按照苹果酸-乳酸发酵时间每72 小时连续取样。

表1 常规理化指标Table 1 Conventional physical and chemical indicators

DB-WAX 毛细管柱 （30 mm×0.25 mm×0.25 μm）、SCION SQ 456-GC 型气相色谱-质谱联用仪：美国 BRUKER 公司产品；75 μm CAR/PDMS 萃取头： 美国 Supelco 公司产品；TDS3 热脱附系统、ODP2 嗅觉检测器：德国Gerstel 公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 香气物质的提取 样品香气物质的提取参照张佳等人的方法[9]，取8 mL 葡萄酒样品置于20 mL 顶空瓶中，迅速密封顶空瓶并于60 ℃水浴加热15 min，将老化后的75 μm CAR/PDMS 萃取头插入样品瓶顶空部分，于45 ℃吸附30 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动仪器进行GC-MS 分析。

1.2.2 GC-MS 检测条件 GC-MS 分析主要参考PLESSAS 等人的方法[10]，采用恒定流量模式，起始柱温 40 ℃，以 5 ℃/min 升至 90 ℃；再以 10 ℃/min 升至 230 ℃， 保留 7 min。 载气为纯度 99.99%的 He气，流量0.8 mL/min，气化室温度230 ℃。质谱条件：电子电离（Electronionization，EI）离子源；电子能量70 eV，接口温度为250 ℃，离子源温度为200 ℃，灯丝发射电流为100 μA，检测器电压1 kV。

1.2.3 挥发性物质的定性和定量分析 定性方法：通过比较质谱与NIST15 质谱数据库来鉴定化合物，保留正、反匹配度均大于800（最大值为1 000）的鉴定结果。

定量方法：采用峰面积归一化法以确定葡萄酒中各组分挥发物的质量分数。

1.2.4 数据分析 主要采用origin 2016 和SPSS 23进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 赤霞珠葡萄酒的香气组成

赤霞珠葡萄酒苹果酸-乳酸发酵阶段挥发性香气成分的动态变化见图1 和表2。 在赤霞珠葡萄酒苹乳发酵期间共鉴定出55 种挥发性香气物质，其中包括酯类（22 种）、醇类（10 种）、酸类（8 种）、醛类（7 种）、酮类（4 种）、萜烯类（3 种）、酚类（1 种）。 由此可见， 赤霞珠葡萄酒的主要挥发性物质为酯类，其次是醇类及酸类。 在苹乳发酵开始时，共检测出48 种挥发性化合物， 其中质量分数超过5%的挥发性物质有乙酸乙酯（5.74%）、辛酸乙酯（5.98%）、苯乙醇 （6.72%） 以及质量分数最高的异戊醇（32.78%）。 而在苹乳发酵末期（18 d）时，共检测出43 种挥发性化合物， 其中质量分数超过5%的挥发性物质有乙酸乙酯（6.8%）、己酸乙酯（5.42%）、辛酸乙酯（8.48%）、苯乙醇（6.03%）以及质量分数最高的异戊醇（20.48%）。 总体来看，苹乳发酵结束后葡萄酒酯类香气成分比开始时有所提升但也失去了一些醇醛类物质，而且还新增加了2 种化合物，分别是月桂酸乙酯和琥珀酸异戊乙酯。

图1 赤霞珠葡萄酒苹乳发酵末期（18 d）挥发性香气成分总离子流图Fig. 1 Total ion chromatogram of volatile aroma components of Cabernet Sauvignon wine at the end of MLF（18 d）

2.2 赤霞珠葡萄酒苹乳发酵时期香气成分质量分数对比分析

2.2.1 酯类化合物 如表2、图2 所示，赤霞珠葡萄酒在苹乳发酵过程中，酚类物质的种类减少，但总质量分数上升。 乙醇发酵结束时共检测出18 种挥发性香气物质，总质量分数为20.7%，为赤霞珠葡萄酒中主要的香气物质。 在苹乳发酵第18 天时共检测出15 种挥发性香气物质，总质量分数为25.61%。相对于乙醇发酵结束时，赤霞珠葡萄酒酯类香气物质总质量分数增加了4.91%， 其中主要为乙酸乙酯和己酸乙酯质量分数的上升，这两种挥发性化合物能够赋予葡萄酒浓郁的果香、酯香和己酸乙酯带来的曲香[11-12]。 香气物质种类减少了3 种，分别为：乙酸异丁酯、苯酸甲酯和乙酸苯乙酯。同时也增加了2种新的香气物质——月桂酸乙酯和琥珀酸异戊乙酯，增加了葡萄酒水果类香气。

表2 赤霞珠葡萄酒苹乳发酵阶段挥发性香气成分动态分析Table 2 Dynamic analysis of volatile aroma components of Cabernet Sauvignon wine during MLF

续表2

续表2

图 2 酯类、醇类、酸类化合物质量分数比较Fig. 2 Comparison of mass fraction of esters，alcohols and acids

2.2.2 醇类化合物 醇类物质总质量分数在苹乳发酵0 d 时最高，为42.89%，随着发酵的进行呈显著减小趋势，直至苹乳发酵第18 天的29.01%，主要为异戊醇、异丁醇、正己醇和苯乙醇等。 有研究表明，葡萄本身携带的酸以及在发酵过程中产生的酸会和醇类物质在葡萄酒后熟阶段发生酯化反应[13-4]，因此使醇类物质总质量分数逐渐减小，这也解释了苹乳发酵过程中酯类化合物质量分数上升的原因。异戊醇作为发酵的副产物，在乙醇发酵结束时质量分数达到最大32.78%，随着苹乳发酵的进行，异戊醇质量分数逐渐降低， 直至苹乳发酵第18 天的20.48%。 异戊醇是乙醇发酵期间酵母菌代谢产生的副产物[15]，具有苦涩味，但适量的异戊醇及高级醇会赋予葡萄酒醇厚感，但质量分数过高会给葡萄酒带来不愉悦的口感以及对人体有毒害作用[16]。 苹乳发酵降低了高级醇的质量分数，保证了葡萄酒的风味口感和安全性。

2.2.3 酸类化合物 赤霞珠葡萄酒苹乳发酵过程中共检测出8 种酸类化合物，质量分数总体呈上升趋势，由发酵前的1.08%上升至2.33%，质量分数变化明显的主要有乙酸、正辛酸、棕榈酸以及苹乳发酵结束后新生成的月桂酸和肉豆蔻酸，其中月桂酸能够赋予葡萄酒花果的芳香气味，肉豆蔻酸则具有椰子和油脂香味，2 种化合物总体上增强了葡萄酒的香气。 张顺花[17]、胡博然[18]等也同样在葡萄酒中检测出不同种类的酸，但未描述其形成机理，而新生成的2 种酸可能是苹乳发酵过程中乳酸菌发酵作用产生的。

2.2.4 萜烯类、酚类及醛酮类化合物 酚类和萜烯类物质种类的质量分数较低且在苹乳发酵过程中变化不大，见图3。 2 类物质在苹乳发酵过程中仅检测出4 种挥发性化合物， 总质量分数保持在1%左右。 其中萜烯类化合物通常以糖苷态存在于葡萄的果实中，能够赋予葡萄酒玫瑰香气，但感官阈值很低[19]。 酚类物质对葡萄酒的香气、颜色、稳定性以及对葡萄酒的味觉平衡具有重要作用[20]，但在本试验中只检测出2，4-二叔丁基酚这一种酚类物质。

图3 萜烯类、醛类、酮类及酚类化合物质量分数比较Fig. 3 Comparison of mass fraction of terpene，aldehydes，ketones and phenols

葡萄酒中的羰基化合物大多数由微生物发酵生成，也有少数是在葡萄酒贮藏过程中发生的美拉德反应和醇类的氧化反应生成。 赤霞珠葡萄酒在苹乳发酵结束时共检测出5 种酮类和7 种醛类化合物， 其中酮类化合物主要为丁二酮和2，3-戊二酮。葡萄酒中的丁二酮的质量浓度在2~4 mg/L 范围内可以增加葡萄酒的香气强度，但超过这个范围会导致葡萄酒香气劣化。 同时在发酵结束后的葡萄酒中检测出微量的2，3-戊二酮（0.04%）。有研究表明，当葡萄酒中的丁二酮与微量的2，3-戊二酮共存时，可以增强葡萄酒的香气，使葡萄酒的香气更加浓郁[21]。醛类物质从乙醇发酵结束后的0.85%下降到苹乳发酵结束的0.55%，以乙醛、苯甲醛和4-丙基苯甲醛质量分数的降低为代表。 其中乙醛具有果香，苯甲醛具有苦杏仁、 樱桃及坚果香味，4-丙基苯甲醛具有枯茗和桂皮类似香气。 这3 种醛类化合物质量分数的下降降低了葡萄酒果香的香气。

3 结 语

本研究表明，在葡萄酒苹乳发酵的过程中共分析鉴定出55 种挥发性化合物，其中酯类、醇类和酸类为葡萄酒主要香气物质。 各类挥发性香气物质在总体上呈现不同的变化趋势，尤其以酯类和酸类以及酮类物质质量分数上升为主要特征，这3 类化合物质量分数的上升增强了葡萄酒水果方面的香气。葡萄酒中酸和醇类物质发生酯化反应降低了醇类物质的质量分数，同时伴随着苹乳发酵结束后高级醇质量分数的降低，保证了葡萄酒的风味并且提高了葡萄酒的安全性。 因此，葡萄酒苹乳发酵能够直接影响葡萄酒的香气和风味特征，但在苹乳发酵的过程中最重要的影响因素为乳酸菌，因此可以利用细菌多样性来改善葡萄酒的香气和风味特征。