姜黄素对高糖波动下视网膜色素上皮细胞的保护作用

李 豪，朱海丽，李 岱

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院五官医学院)

近年来的研究表明糖尿病及其并发症的发生与发展不仅与血糖含量升高有关，也与体内血糖水平的波动有密切联系[1]。血糖波动指血糖水平在其高峰和低谷之间变化的不稳定状态，不仅包括短期血糖波动，即日间血糖波动和日内血糖波动，还包括长期血糖波动[2]。糖尿病患者血糖值的不稳定状态对各组织造成的损伤已逐渐引起了人们的重视，但对眼部损伤的相关研究甚少，因此，对血糖波动条件下眼部细胞的研究有助于我们对糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)的治疗。

DR的最主要病理变化是眼部微血管病理性改变，其中RPE细胞作为视网膜最外层的主要细胞，在维持正常视觉方面起了重要作用。它向外与脉胳膜相连参与血—视网膜屏障的形成，向内参与视网膜光感受器的视觉形成，如果RPE细胞发生损伤则人的正常视力会受到严重损害。糖尿病患者血糖水平较常人高，高糖环境会对RPE细胞造成损伤，但许多患者血糖水平并非一直维持恒定，而是随时间发生波动变化，目前对于血糖波动环境下视力损害已有所认识，但还没有有效方法抑制这一损害。鉴于RPE细胞在视网膜中的重要性及对血糖浓度的敏感性[3]，因此，我们选用RPE细胞作为我们的模型细胞。

姜黄素(curcumin，Cur)是一种从姜科、天南星科等植物中提取的一多酚类化合物，具有降血糖、降脂、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗抑郁等多种药理效应，其广泛运用于治疗各种糖尿病、心血管、呼吸、神经、自身免疫等多系统的疾病。姜黄素可改善糖尿病引起的视网膜血管内皮细胞超微结构改变，减少细胞凋亡[4]，从而改善DR的临床表现。本研究通过建立波动高糖条件下的ARPE-19细胞模型，探讨姜黄素对细胞模型的保护作用，为DR的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞株：人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19) (中山眼科中心所提供)，姜黄素 (纯度≥98%，Sigma 公司)，胎牛血清 (Gibco)，DMEM培养基(Gibco)，CCK-8试剂盒(Sigma-Aldrich)，活性氧 ROS 测试盒(Sigma-Aldrich)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模

我们依据前人的成功造模经验[5]，将正常培养的ARPE-19细胞分成正常血糖组(normal glucose，NG)、波动高渗组 (osmotic control，OC)、高糖组(high glucose，HG)、波动高糖组 (intermittent high glucose，IHG)、血糖波动+低浓度给药组(IGH+10μg/mL Cur)、血糖波动+中浓度给药组(IGH+20μg/mL Cur)、血糖波动+高浓度给药组(IGH+40μg/mL Cur)共7组。正常组用5.5mmol/L DMEM完全培养基培养，高糖组用33 mmol/L DMEM完全培养基培养，波动高渗组用含有5.5mmol/L甘露醇的DMEM培养基和含有25mmol/L甘露醇的DMEM培养基中波动培养，每12h波动一次，模拟波动高糖组相似的波动性高渗环境。波动高糖组日间高糖3h低糖2h，波动3次，高糖过夜，24h为一周期。血糖波动+低浓度给药组、血糖波动+中浓度给药组、血糖波动+高浓度给药组分别用含有10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL姜黄素的正常培养基和高糖培养基按血糖波动组方法培养。每组细胞培养3d后进行后续实验。

1.2.2 细胞形态学观察

将分组培养3d后的ARPE-19细胞置于倒置显微镜下，观察各组细胞的形态差异。

1.2.3 细胞活力检测(CCK-8法)

将正常培养的ARPE-19细胞制成细胞浓度为5～10×104/mL的细胞悬液，将均匀的细胞悬液加入到96孔板中，其中每孔加入200μL，置于培养箱24h待细胞贴壁。将已贴壁的96孔细胞吸弃培养液，PBS洗涤后，加入无血清培养基2h，同步化后按照相应的分组进行干预。药物干预3d后，每孔内加入10μL CCK-8溶液，继续培养4h。待各组颜色分明，酶标仪检测450nm 处各孔的OD值，实验重复6次。

1.2.4 细胞ROS水平的检测(免疫荧光法)

(1)荧光图像采集。选取生长融合程度接近 80%～90%的细胞，经过胰酶消化、重悬后，计数并用含10%血清的DMEM制备细胞悬液，调整细胞浓度，每孔1mL提前一天接种于6 孔板上。待细胞融化度达到 70%左右，用不含血清的培养基进行同步化处理 2h。随后将细胞进行分组培养。细胞分组培养及药物干预3d后，将DCFH-DA探针直接加入到每组的培养基中，使探针的终浓度达到10μM。操作过程中，注意避光，尽量在暗环境进行操作，也可以在加入探针后，将孔板用锡箔纸进行包裹，然后在培养箱中继续培养30min。暗环境下用预温PBS清洗 3 次，清洗结束后，荧光显微镜下观察及拍照。

(2)荧光强度检测。将混匀后的细胞悬液接种到96孔板内，每组设6个复孔，按分组培养细胞，3d后完成细胞造模，每孔加入DCFH-DA 探针继续培养30min，PBS清洗3次，将96孔板置入多功能酶标仪中，激发波长485nm，发射波长525nm进行细胞内荧光强度的检测。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 各组形态学差异

图1(封二)中可以看到正常组细胞NG形态呈长梭形，形态清晰，细胞接连紧密，成片生长。波动高渗组OC中部分细胞呈卵圆形，但大部分细胞形态完整，与正常组相同。高糖组HG及波动组IHG中只有少数细胞呈正常的长梭形，且波动组中大部分细胞形态不完整。随着姜黄素含量的增加，细胞逐渐趋于正常，当达到40μg/mL时细胞大部分呈梭形，形态完整，提示此组细胞在波动高糖条件下的损伤最小。

2.2 各组细胞活性

通过CCK-8检测不同条件下的细胞活性，我们发现不同条件处理后的ARPE-19细胞活性有了显著的差异(P<0.05)。HG细胞活性较NG组有所降低(P<0.05)，IGH组的细胞活性较GH组降低更为明显(P<0.05)。OC组与NG组相差不大(P>0.05)，与IHG组有显著差异(P<0.05)，IHG+姜黄素组的细胞活力增强(P<0.05)，其中IHG+40μg/mL姜黄素组的细胞活力最强，见表1。

表1 各组ARPE-19细胞活性对比

2.3 细胞内ROS水平检测(化学荧光法)

正常组NG和波动高渗组OC荧光水平明显最弱，高糖组HG较正常组高，波动高糖组IHG在本次试验中荧光水平最高的。而在波动高糖+姜黄素组荧光水平已经十分接近正常组，与高渗组相当，而其它两组的荧光强度仍然较强。见图2(封二)。

将各分组ARPE-19细胞培养3d后，使用酶标仪对各组细胞内ROS水平进行定量分析，其结果与荧光图片基本一致。见表2。

表2 ARPE-19细胞内ROS荧光强度

3 讨 论

由于一直认为高糖是DR的主要因素[6]，所以以往的研究更重视高糖环境对视网膜的损害，对于血糖波动环境下RPE的损伤机制的研究较少，但是DM患者由于胰岛素抵抗、饮食控制不良、运动缺乏导致机体血糖值较正常人波动幅度明显增大[7]，大幅的血糖波动使组织细胞对高糖的适应性降低，从而使机体受到更严重的损害[8]。有研究表明姜黄素能够抑制高糖环境下DR的损伤[9-11]，但对于血糖不稳定DR患者的视力保护机制尚不清楚。鉴于姜黄素的药理作用，本课题对姜黄素抑制血糖波动环境下RPE的损害机制进行了研究和记录。本研究发现血糖波动环境下RPE细胞的氧化应激、细胞凋亡及形态改变较正常组加强，并且强于持续高糖组，这表明波动高糖较持续高糖对细胞的伤害更加严重，氧化应激可能在细胞的损伤中起重要作用。同时我们用不同浓度姜黄素对各组细胞进行干预，发现血糖波动环境下RPE细胞的氧化应激、形态改变均有不同程度的改善，这说明姜黄素的确能够对血糖波动环境下对RPE细胞起保护作用。

人RPE细胞处于脉络膜和视网膜神经上皮层之间，是吸收眼底光线的主要部位，其解剖位置使其长期处于高氧化环境，因而极易受到氧化损伤，当细胞内源性抗氧化系统无法清除过量的ROS时，过剩的 ROS 就会造成细胞毒性作用， 这一过程就称为氧化应激。研究表明高糖环境下的RPE细胞会因为氧化应激导致细胞功能损害与凋亡[12]，但波动高糖环境是否会加剧RPE细胞的氧化应激反应还尚不清楚。本研究中我们发现波动高糖组中的ROS表达量显著高于其它组，并且CCK-8结果表明波动高糖组的RPE细胞活力最低，值得注意的是波动组的ROS表达量明显高于持续高糖组，提示氧化应激可能是波动高糖环境下RPE细胞损伤的重要途径。过量的ROS可以使RPE细胞中的核转录因子NF-κB表达上调[13]，活化的NF-κB可使TNF-α、IL-1β等细胞因子增加[14]，同时TNF-α、IL-1β等也可使NF-κB被激活[13]，从而形成正反馈，加速RPE细胞的损伤。由于DR本质是炎症疾病，炎性介质在DR的发展过程中发挥着重要作用，因此，我们推测波动高糖环境下ROS的增加同样也会使RPE细胞炎性因子的表达增加，导致细胞凋亡，所以抑制波动高糖中RPE细胞氧化损伤的药物，对DR的临床治疗具有重要意义。

姜黄素具有降血糖、抗氧化、抗炎等多种药理效应，可改善糖尿病引起的视网膜血管内皮细胞超微结构改变，降低氧化反应，减少细胞凋亡[15]，从而改善DR的临床表现。本实验通过血糖波动细胞模型，分别与正常血糖组与高糖组进行对比，同时设立波动高渗组排除波动组中渗透压对细胞的影响，结果表明，血糖波动对细胞的损伤最大，而随着姜黄素浓度的增加，波动高糖组中的RPE细胞形态活力逐渐趋于正常，ROS水平下降，说明姜黄素对血糖波动环境下的RPE细胞具有较好的保护作用。由于RPE细胞的氧化应激反应会促进炎性因子过表达，导致细胞凋亡，因此，在今后的工作中进一步探讨血糖波动对RPE细胞的凋亡机制以及姜黄素对细胞的保护任务用，为姜黄素治疗DR的临床应用打下基础。