线粒体靶向载体的合成以及生物活性研究*

王 睿，董 超，金小红，高 涛**

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院非动力核技术与化学生物学院)

线粒体是真核细胞中重要的细胞器，在细胞的能量代谢，钙稳态调控及细胞凋亡控制中发挥重要的作用[1-2]。许多疾病如癌症、阿尔茨海默症、糖尿病、衰老等都和线粒体的状态相关[3]。因此，线粒体也是细胞的“状态风向标”。以肿瘤细胞为例，肿瘤细胞的无序增殖，需要更多的能量参入细胞的代谢。因此，正常细胞和癌细胞的线粒体存在较大的差异[4]。研究发现，癌细胞线粒体的跨膜电势远高于正常细胞线粒体，以此为靶点的药物能富集于癌细胞线粒体，药物在癌细胞中浓度比正常细胞高近千倍[5]。在使用此类药物进行治疗时，可以极大地提高药物对肿瘤细胞的活性而降低对正常细胞的影响，是解决抗肿瘤药物的副作用及耐药性的重要手段[6-8]。此外，将抗氧化的小分子化合物靶向进入线粒体，也是合成治疗神经退行性新疾病及抗衰老药物的重要策略[9]。

药物的线粒体靶向功能的实现，和线粒体靶向载体的选择密切相关。目前常用的线粒体靶向载体有 Rhodamine-123、F16、三苯基膦盐等电子移位亲脂性阳离子(DLCs)[10-12]。但是这些化合物存在荧光强度弱，合成难度大，细胞毒性大的弱点，有待进一步的改进。作为前期工作，本课题组在线粒体靶向载体的筛选方面做了大量的预研工作。我们使用吡啶-4-甲醛合成了具有荧光特性的化合物吡啶-BODIPY，进一步通过碘甲烷对吡啶进行修饰，合成了吡啶盐-BODIPY。该化合物展现出荧光量子产率高，细胞毒性低、稳定性好的优势，并且具有线粒体靶向功能，是一种非常优秀的线粒体靶向荧光母体。因此，使用吡啶盐-BODIPY对二碳基配体进行修饰，合成得到了化合物PBT；通过核磁氢谱、碳谱对化合物进行了表征；利用MTT实验研究了PBT对人肺腺癌细胞(H1975)的细胞毒性；并使用激光共聚焦显微成像技术研究PBT的线粒体靶向能力。上述研究表明，PBT是一种生物相容性好、光物理性质稳定的新型线粒体靶向荧光载体，该研究对线粒体靶向药物的研发具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ZF-6型三用紫外分析仪(巩义市予华仪器有限责任公司)，日立F-4500型荧光分光光度计(日本日立)；400M型核磁共振仪(德国布鲁克)；LCMS8040型液质联用仪(日本岛津)；NOL-LSM 710型双光子激光共聚焦显微镜(德国蔡司)；所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

以4-吡啶甲醛、2，4-二甲基吡咯、三氟化硼乙醚为原料，经两步反应合成荧光化合物1；1，4-二溴丁烷和对羟基苯乙酮在碱性条件下制备化合物2；化合物2进一步和三氟乙酸乙酯反应制备化合物3；化合物1和3在高温回流的条件下制备得到目标化合物4(PBT)。图1为PBT的合成路线。

图1 载体化合物的合成路线图

1.2.1 化合物1的合成

常温下，将4-吡啶甲醛(428mg，4mmol)溶于400mL干燥二氯甲烷中，加入2，4-二甲基吡咯(760mg，8mmol)与催化剂三氟乙酸2滴，常温反应8h。然后加入DDQ(908mg，4mmol)，常温条件反应2h后加入8mL三乙胺和5mL三氟化硼乙醚，再常温反应8h，反应结束，加入等量碳酸氢钠溶液，萃取后取有机层，旋干得黑褐色油状物质。采用柱层析提纯(400目硅胶)，洗脱剂比例(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1，V/V)，得化合物1(390mg，产率30%)橙色固体。

1H NMR (400MHz，CDCl3)δ8.78(d，J=5.6Hz，1H)，7.30(d，J=5.7Hz，1H)，6.01(s，1H)，2.56(s，3H)，1.41(s，3H)。13CNMR(101MHz，CDCl3)δ156.45，150.67，143.55，142.67，137.66，130.34，123.29，121.82，77.42，77.10，76.78，14.62。

1.2.2 化合物2的合成

在500mL圆底烧瓶中加入N，N-二甲基甲酰胺(200mL)，再加入1，4-二溴丁烷(2.13g，10mmol)和无水碳酸钾(1.38g，10mmol)，搅拌0.5h。再取对羟基苯乙酮(0.68g，5mmol)溶于30mL N，N-二甲基甲酰胺，将所得溶液添加至初始溶液中，常温条件下继续反应12h。反应液进行过滤，除去无水硫酸钾固体，将滤液溶于两倍体积水中，用等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层。无水硫酸钠干燥有机层，过滤掉无水硫酸钠，浓缩有机相，将浓缩液过柱层析柱(400目硅胶，展开剂：石油醚)，得化合物中间体(1.74g，产率80%)黄色油状物。

在50mL圆底烧瓶中加入0.15g氢化钠(50%)和10mL干燥的四氢呋喃，通入氮气保护，置于冰浴中搅拌，缓慢滴加三氟乙酸乙酯(1.42g，10mmol)，搅拌10min。待温度降到零摄氏度后，将第一步所得黄色油状产物(2.56g，10mmol)溶于5mL四氢呋喃中，滴加至反应瓶中，滴完后，室温条件下搅拌6h。反应液用50mL水淬灭，用30mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，取有机层干燥，旋干得黄色固体。过柱层析(400目硅胶，洗脱剂丙酮∶正乙烷=1∶6，V/V)，得产物化合物2(2.74g，产率75%)红色晶体。

1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.92(d，J=8.9Hz，1H)，6.97(d，J=8.9Hz，1H)，6.50(s，1H)，4.09(t，J=5.9Hz，1H)，3.50(t，J=6.4Hz，1H)，2.14-2.04(m，1H)，2.04-1.94(m，1H)。13C NMR(101MHz，CDCl3)δ186.18，175.91，163.86，131.09，130.07，125.49，118.85，116.04，114.79，91.57，91.55，77.35，77.03，76.72，67.35，33.18，29.29，27.69。

1.2.3 化合物3(PBT)的合成

取吡啶盐-BODIPY(0.36g，1mmol)和化合物2(0.367g，1mmol)于50mL圆底烧瓶，加入适量的甲苯，加热回流过夜。反应产生红色固体，用二氯甲烷重结晶，即可得到纯品化合物PBT(0.28g，产率40%)。

1H NMR(400MHz，DMSO)δ 9.22(s，1H)，8.25(s，1H)，7.72(d，J=18.1Hz，1H)，6.90(d，J=47.0Hz，1H)，6.06(s，1H)，4.67(s，1H)，3.94(s，1H)，2.26(s，4H)，1.97(s，1H)，1.55(s，1H)，1.19(s，3H)。13C NMR(101MHz，DMSO-d6)δ195.57，185.92，172.54，163.07，157.33，151.28，146.57，142.91，135.16，131.70，130.69，130.37，129.92，129.45，128.90，122.92，114.89，114.69，93.13，92.81，67.69，61.21，44.51，42.41，40.53，40.32，40.11，39.90，39.69，39.48，39.28，28.13，25.45，21.53，15.24，14.79，8.96。

2 结果与讨论

2.1 PBT的光物理性质

PBT的光学性质在甲醇溶液中以10μmol/L的浓度进行研究(如图2所示)，现化合物PBT具有较好的光学性质，其吸收波长最大为510nm，最大发射波长为585nm。

深色线条为紫外吸收光谱，浅色线条为荧光发射光谱

2.2 细胞毒性实验

通过MTT法(具体步骤见表1)研究化合物3对人肺腺癌细胞(H1975)的生物活性。PBT的细胞毒性结果见图3。由图3可以看出，PBT对H1975的生物活性影响较小，证明该配体毒性很小，具有较好的生物相容性。

表1 MTT法的具体步骤

图3 化合物PBT的细胞活性图

2.3 细胞线粒体定位实验

将人宫颈癌细胞(HeLa)铺于经特殊处理的小皿内，其具有良好透光性，待细胞贴壁后，换用含5μmol/L化合物3的培养基处理0.5h。弃培养基，加PBS，加入2μM MTR(MitoTracker®Red CM-H2XRos)对细胞线粒体进行染色标记。置于培养箱中37℃避光染色0.5h后，弃染色液，加入PBS，利用共聚焦显微镜对荧光信号进行检测，并记录结果。

在共焦激光扫描显微镜下研究了化合物PBT细胞线粒体定位能力(见图4，封二)。如图4所示，化合物PBT具有绿色荧光信号，线粒体荧光染料具有红色荧光信号，且化合物PBT产生的绿色荧光信号与线粒体荧光染料产生的红色荧光信号完全重叠。化合物PBT的细胞线粒体定位实验表明，其在细胞内主要集中的细胞器是线粒体，具有线粒体靶向特性，能在细胞线粒体中选择性集聚。化合物PBT在细胞中具有良好的线粒体靶向特性和亚细胞实时成像能力。

3 结 论

以吡啶盐-BODIPY为荧光母体修饰二碳基配体，合成得到线粒体靶向载体PBT，通过核磁氢谱和碳谱明确了化合物结构。进一步，用过紫外和荧光分光光度计研究了化学PBT的光物理性质。通过MTT实验评估的化合物的细胞毒性，发现化合物的细胞毒性极低，具有非常好的生物相容性。在此基础上，通过激光共聚焦显微成像技术，使用线粒体商品染料MTR，研究PBT的细胞成像及亚细胞的定位能力，发现化合物具有较好的线粒体定位成像能力。综上，化合物具有生物相容性好，光物理性质稳定，能靶向进入线粒体，是一例非常优秀的线粒体靶向载体。PBT分子中独特的二羰基结构可以负载铂等稀土化合物，可以用于线粒体荧光探针及线粒体靶向抗肿瘤药物的合成。