AMPKα2基因敲除鼠饲养繁殖及基因鉴定*

张飞雪，吴宁华，汪佳佳，许丹丹，刘秀芬

(湖北科技学院医药研究院/糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100)

AMPK(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK) 是一个能量调节代谢的关键分子[1]。它是由一个催化亚基(α)和两个调节亚基(β，γ)组成的异源三聚体复合物[2]。其中，α 亚基中的α1和α2是催化亚基，其结构域中172 位点苏氨酸的磷酸化是AMPK 激活的必要条件[3]。可通过药理化合物激活AMPK，如AICAR 或二甲双胍治疗，实验证实AMPK 激动剂能够抑制心肌肥厚，延缓心脏重塑[4]。在心肌慢性缺氧的条件下，AMPKα2敲除小鼠的自噬水平比野生型小鼠显著降低，而在心脏和骨骼肌中，AMPKα2 的表达占总额的70%～80%，AMPKα1活性仅占总的20%～30%[5]。以上研究提示，在糖尿病心肌病中，心脏中AMPKα2 亚基可能发挥更大的作用。

本研究使用北京维通达生物技术有限公司制备的C57BL/6J(C57)-AMPKα2敲除鼠，经过在SPF级动物房合理的饲养繁殖鉴定，得到了一批可用于实验研究的AMPKα2敲除鼠。

这将为该课题组在糖尿病心肌病AMPKα2这条通路的探讨中提供很好的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

AMPKα2基因敲除杂合子小鼠由北京维通达生物技术有限公司提供[SYXK(京)2016-0006]；在湖北科技学院医药研究院SPF级动物房[SYXK(鄂)2018-0071]中繁殖扩群。 饲喂普通钴60辐射维持饲料购自武汉万千佳兴生物科技有限公司提供，饲养环境：昼夜各半循环照明，湿度恒定，温度控制在20℃～ 26℃。所有操作均符合湖北科技学院医学实验伦理学要求。

1.2 实验仪器

Bio-rad T100型梯度PCR仪、北京六一DYY-6C型双稳定时电泳仪、Bio-rad 电泳仪。

1.3 小鼠的饲养与繁殖

小鼠的饲养与繁殖均在湖北科技学院医药研究院SPF级动物房中，屏障内环境均符合国家对实验动物环境设施的要求：温度：20℃～26 ℃；相对湿度：40%～70%；垫料、笼器具均进行高压真空灭菌；饲料是经过钴60辐射消毒，避免高温高压对饲料营养损伤；饮水经净水器处理并装瓶后高压达到纯净无菌要求，动物饮水采用自由饮水的方式；鼠笼的垫料隔天更换一次，保证小鼠居住环境的洁净度。将6只小鼠按照雌雄5∶1合笼，5只母鼠妊娠期和正常小鼠相同也为21 d左右，每窝子代数量6～10只，哺乳期为28～30 d，断奶后，剪取幼鼠尾尖0.2～0.3 cm组织，放入0.6mL的EP管中放入-20℃冰箱备用，同时打耳号标记。小鼠的性成熟期为60 d左右，大量繁殖时采用纯合子敲除小鼠雌雄2∶1比例合笼，根据孟德尔遗传规律，生出的子代应该全为纯合子敲除，为了使结果更为准确，随机每窝取2只小鼠进行鉴定。

1.4 小鼠的基因型鉴定

引进小鼠均为AMPKα2基因敲除杂合子小鼠，配对繁殖后依据孟德尔遗传定律其子代会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型，纯合子即是我们需要的基因型，下一步扩繁可选用将纯合子敲除小鼠雌雄合笼得到的全为纯合子敲除小鼠，这样将大大节约了成本和时间。

1.4.1 鼠尾DNA提取

将上述取的鼠尾组织取出，每个样品管加入组织裂解液50～100μL，样品在恒温振荡器中56℃保温4h或过夜，同时以250r/min震荡，以使组织块彻底消化裂解，裂解好的样品在恒温加热块或PCR仪上95℃加热10min，然后冷却至4℃备用，上述制得的裂解样品可以直接作为PCR检测的DNA模板溶液，对于20μL的PCR反应体系，需要加本裂解样品0.2～1.0μL作为DNA模板，本研究取0.3μL的裂解样品。

1.4.2 PCR反应及琼脂糖凝胶电泳

(1)PCR反应。鉴定引物序列由维通达生物技术有限公司提供，由上海生工合成。引物1-上游：5'-GCTTAGCACGTTACCCTGGATGG-3'；引物2-下游1：5'-GCATTGAACCACAGTCCTTCCTC-3'；引物3-下游2：5'-GTTATCAGCCCAACTAATTACAC-3'。三种引物按照2∶1∶1的比例混合至10μmol/L，进行PCR反应。PCR反应体系(25μL)：2×Taq PCR Mix 12.5μL，上述三种引物混合液4μL，模板DNA 0.3μL，灭菌ddH2O 8.3μL补足至25μL。使用PCR扩增仪进行Touchdown循环扩增：94℃预变性5min；95℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存备用。

(2)琼脂糖凝胶电泳。将PCR反应终产物8μL于2%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。然后依据琼脂糖凝胶基因型200bp和600bp片段大小分辨出各类基因型小鼠。

1.5 AMPKα2基因在心肌中的表达

扩繁后，每种基因型随机选取3只小鼠，采用脱臼处死，分别取出心脏组织，每只小鼠的心脏各取40mg，整个过程在冰上进行，然后配裂解液：裂解液(RIPA)∶钒酸钠∶PMSF(蛋白酶抑制剂)∶cooktail(磷酸酶抑制剂)=100∶1∶1∶1，组织∶裂解液=1mg∶10μL，在研磨仪上充分匀浆，匀浆后12000r/min，离心15min，取上清，在酶标仪上测出标准蛋白浓度和组织蛋白浓度，根据标准蛋白浓度标准曲线计算出组织蛋白浓度，加入裂解液调体积，之后加入3×Buffer，95℃加热10min即可，一般调好的蛋白浓度在2～3μg/μL，通过western blotting检测AMPKα2的表达。

2 结 果

2.1 小鼠基因型鉴定的结果

根据公司提供鉴定方法的建议：野生型(AMPKα2+/+)则只有约200bp的条带；杂合子敲除(AMPKα2+/-)则同时出现约200bp和约600bp两个条带；纯合子敲除(AMPKα2-/-)则仅出现600bp的条带。从图1可以看出2号鼠仅出现一条约为200bp的条带，为AMPKα2+/+(WT)；3号鼠同时出现约200bp和约600bp的条带，为AMPKα2+/-；1、4、5、6、7、8号均仅出现一条600bp的条带，为AMPKα2-/-(KO)。

M代表marker；数字代表小鼠的编号

2.2 AMPKα2基因在心肌中的表达情况

随机选取3只AMPKα2-/-鼠和3只同窝WT鼠，取其心肌组织进行蛋白电泳，如图2所示3只WT小鼠的AMPKα2蛋白的表达量均正常，而3只AMPKα2-/-鼠几乎没有AMPKα2蛋白的表达，说明AMPKα2-/-鼠造模成功，为下一步糖尿病心肌病研究提供了良好的动物模型。

图2 AMPKα2基因在心肌中的表达

3 讨 论

在医学的基础科学研究中，基因工程动物模型是不可或缺的研究载体，小鼠因体型小，价格便宜，易于饲养繁殖等优点，成为了基因工程鼠的首选动物。

SPF级动物房的环境是小鼠正常繁殖的关键因素，本研究所在的动物房均符合国标GB14925-2010对环境设施的要求，本研究在该基因型小鼠的饲养繁殖过程中发现，噪音是小鼠繁殖的关键，小鼠出生前后尽量将怀孕雌鼠放在相对安静独立的空间，如果噪音大于60分贝或者人流量较大都将会造成母鼠烦躁不安、不哺乳，造成仔鼠死亡，而这种现象不加以控制，会造成所有小鼠繁殖力低下，进而导致该基因鼠的绝种。有研究表明很多基因敲除小鼠都有食子现象[6]，每天减少观察小鼠的次数，这样可以避免对小鼠的惊吓，给予花生米、葵花籽以及熟鸡蛋黄发现食子现象得到很好的缓解[7]。本研究在怀孕雌鼠生仔后出现雌鼠不喂奶反而将其仔吃掉，我们立即采取上述措施，得到了数量足够多的AMPKα2敲除鼠，不但有足够多的数量可以保种，还为下一步实验研究提供了动物模型。

小鼠断奶后，本研究采取打耳号的同时剪取小鼠尾尖，通过尾尖组织提取DNA的方式进行鉴定，这种方式大大提高了鉴定的准确性。对于需要大量动物模型进行科学研究的实验来说，需要同时大量繁殖，获得同日龄的小鼠，这样在同一时间内需要鉴定的仔鼠数量就很多，而通过剪趾甲的方式就不太适合，一是小鼠生长快，如果剪的不到位很容易造成误判，二是数量多容易造成混淆，而通过该研究的方式既准确又方便快速。

PCR的鉴定方法方便、简单、快速、准确，所需组织DNA样本少，取完小鼠的尾尖不影响小鼠的正常生活，也不会干扰后续的实验研究。该基因鼠的繁殖鉴定方法的确立为该课题组更深层次的研究和探索提供了物质基础。