KRAS基因在胰腺癌中的临床意义分析*

吴 喆，韩 璐

(湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁 437100)

胰腺对人体来说至关重要，其具有内分泌和外分泌的作用。据《2012中国肿瘤登记年报》统计，在我国经济发达地区，胰腺癌新发估计病例数列男性第6位，女性第7位，并且呈快速上升趋势[1]。作为一种消化道恶性肿瘤，胰腺癌5年生存率低于10%，80%的胰腺癌患者确诊时已经是中晚期[2]。如何早期发现胰腺癌患者，扩大未转移患者的比例，是提高胰腺癌治疗效果的关键[3]。KRAS是一个原癌基因，临床数据表明[4-5]，KRAS突变的患者生存期要远低于未发生KRAS突变的患者，接近90%的胰腺癌患者会发生KRAS突变，然而KRAS在胰腺癌中表达及预后的报道，目前尚不多见。本研究拟应用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据，分析KRAS在胰腺癌发生和发展中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 资料来源

纳入统计的资料均来自TCGA PanCancer Atlas数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/，截止时间为2020年6月)，TCGA胰腺癌原始数据来自NCI(National cancer institute)，突变数据来源GDAC Firehose。

1.2 基因KRAS在胰腺癌中的表达分析

通过cBioPortal平台(http://www.cbioportal.org)，获得TCGA数据库中的184例胰腺癌样本，其中175例临床样本均具有完整的基因序列(含miRNAseq 、mRNAseq 数据)和拷贝数变异(CNAs)，应用Oncoprint、Mutations及Plot选项分析KRAS基因的表达情况。

1.3 基因KRAS的主要相关蛋白及其功能分析

应用GeneCards平台(http://www.genecards.org/)查找KRAS基因相关蛋白，构建KRAS相关蛋白网络树图。通过STRING(https://string-db.org/)查找并归纳相关蛋白的功能，进行蛋白生物作用途径的富集分析。

1.4 基因KRAS在胰腺癌中的生存分析

通过cBioPortal 平台应用survival 选项分析175例样本中基因KRAS表达与生存时间的Kaplan-Meier 关系图，以及log-rank检验KRAS基因变异与胰腺癌预后无复发生存期(relapse-free survival，RFS)的关系。

1.5 统计学方法

生存分析采用Kaplan-Meier (K-M)曲线，Log-rank检验比较差异，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 KRAS基因在胰腺癌中的表达情况

TCGA数据库中，175例胰腺癌样本中有117例发生KRAS基因变异，变异率为67%，包括扩增(Amplification)8例(1.08%)见图1。外显子测序结果显示，KRAS基因主要作用于Ras基因家族，多数KRAS基因突变(131个)发生于Ras的12号密码子(G12 D/V/R)，见图2。多序列比对结果显示见图3。

图1 KRAS基因在胰腺癌中的变异情况(截取的部分热图)

图2 KRAS基因的外显子测序结果

图3 Ras中突变的多序列比对结果

2.2 KRAS基因的主要关联基因分析

应用Co-expression选项，得到KRAS基因的1个主要正相关(positively correlated)基因，为TMOD3，Spearman相关系数值为0.7，如图4(封三)所示，即说明KRAS基因突变发生时往往伴有其他基因的改变。此外，应用Enrichments选项选择Mutations，得到KRAS基因1个有显著性的共突变基因，为TP53基因，见图5A(封三)；图5B(封三)则显示，KRAS基因突变组与KRAS基因未突变组中TP53基因及其他基因的突变频率，其中TP53基因在KRAS基因突变组的突变频率为76.92%(90/117)，p-Value为1.49 e-9。

2.3 KRAS基因主要相关蛋白网络关系分析

应用GeneCards分析KRAS基因主要相关蛋白，主要蛋白包括ARAF、BRAF、RAF1、NRAS、HRAS、PIK3CA、PIK3CG、SOS1、EGFR、ERBB2。把上述基因全部输入STRING平台(https://string-db.org/)，构建得到基因KRAS相关蛋白网络图，见图6(封三)。节点数：11，边数：49，平均节点数：8.91，局部聚类系数(local clustering coefficient)：0.918，PPI富集P值：3.95e-09，通过STRING，将以上蛋白进行通路富集分析，其涉及的生理过程主要包括蛋白质磷酸化、MAPK级联反应、MAP激酶活性的正调控及细胞内信号转导等，见表1。

表1 KRAS基因相关蛋白参与的主要富集生理过程[Biological Process(GO)]

2.4 KRAS基因变异与胰腺癌的生存率比较

KRAS基因与胰腺癌患者生存率的比较，如图7(封三)所示。KRAS变异组总生存时间(中位数为19.48月)显著低于无变异组(中位数为29.99月)(P=0.0347)，见图7A；KRAS的变异与患者无病生存时间有关(P=0.050)，见图7B。

3 讨 论

胰腺由于位置深、早期症状不明显以及缺乏有效的胰腺癌筛检与治疗手段，使得晚期胰腺癌的手术死亡率较高，而治愈率偏低[6]。目前研究表明[7]，Ras基因是人类癌症中突变最频繁的癌基因家族，与人类肿瘤相关的基因有三种：NRAS、HRAS和KRAS，分别定位在1、11和12号染色体上。在Ras基因家族中，KRAS对人类的癌症影响最大，KRAS基因突变比例超过80%，往往发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致[8]。其他研究证实[9-10]，KRAS基因就像体内一个“分子开关”，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用，正常的KRAS基因可抑制肿瘤细胞生长，而一旦发生突变，则导致细胞持续生长，从而导致肿瘤的发生。

资料表明[11]，绝大多数的胰腺肿瘤都存在KRAS基因突变，然而KRAS并不能作为胰腺癌的特异性生物标志物，说明其对胰腺癌的发生和发展以及预后的影响是十分复杂的。本研究应用TCGA、cBioportal及GeneCards 在线数据发现，KRAS基因突变主要为错义突变，且绝大多数突变位点在12号密码子，这与朱晓丽等[12]报道我国结直肠癌患者中KRAS突变类型多为GGT > GAT(G12D)、GGT > GTT(G12V)相一致。本研究基于生物信息学分析了KRAS基因的主要关联基因，比较了KRAS基因与TMOD3基因的mRNA表达水平，发现TMOD3与KRAS基因在胰腺癌中存在共表达关系。TMOD3是一个蛋白质编码基因，与该基因相关的基因本体(GO)注释包括影响肌动蛋白结合和原肌球蛋白结合、调控极化上皮细胞形态，在多种恶性肿瘤的侵袭和转移中起重要作用。现有文献报道[13]，TMOD3可通过MAPK/ERK信号通路促进肝癌细胞的生长、侵袭和迁移，可能成为肝癌的候选生物标志物。本研究还发现，KRAS基因发生突变的胰腺癌患者也有较大可能出现TP53基因突变，TP53也是与人类恶性肿瘤相关性最高的一种抑癌基因，结果提示TP53和KRAS基因可能存在协同作用，即说明及早对患者进行TP53和KRAS基因检测，可能实现对部分胰腺癌患者的早期预警。本研究通过生物学通路和蛋白质互作网络分析等生物信息学方法，鉴定了KRAS基因的主要关联蛋白，这些蛋白包括NRAS、HRAS、ARAF、BRAF、RAF1、PIK3CA、ERBB2、EGFR、SOS1、PIK3CG。通过富集分析，其涉及的生理过程主要包括蛋白质磷酸化、MAPK级联反应及MAP激酶活性的正调控等，与细胞内信号转导通路RAS-MAPK密切相关，该通路有可能成为将来胰腺癌治疗的一个潜在靶向通路。

胰腺癌是预后最差的恶性肿瘤之一，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌[14]。临床数据表明[15-16]，未接受治疗的胰腺癌患者的生存期约为4个月，接受旁路手术治疗的患者生存期约7个月，切除手术后患者一般能生存16个月。早期诊断和早期治疗是提高和改善胰腺癌预后的关键，手术后应用放化疗等辅助治疗可提高生存率。对手术辅助化疗并加用放疗的患者，其2年生存率可达40%。本研究发现，发生KRAS突变的胰腺癌患者的死亡人数远高于未发生KRAS突变的胰腺癌患者人数，且变异率低的患者生存时间较长，提示KRAS基因突变与胰腺癌预后差有显著的相关性，KRAS基因可能成为胰腺癌患者预后良好的一个指标。

综上所述，本研究初步确认KRAS的表达可能不能作为胰腺癌患者的独立预测因子，但KRAS和TP53基因的异常表达与胰腺癌患者的生存及不良预后密切相关，分析了KRAS基因所调控的RAS-MAPK通路及相关蛋白，为KRAS基因在临床上针对胰腺癌的早期筛检提供了一定的参考价值。