B 型流感病毒NP 蛋白双单克隆抗体夹心ELISA 检测方法的建立

徐 菱，张振宇，郭 兴，于萌萌，王晓钧

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069）

流感病毒属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒属。根据病毒核蛋白（Nucleoprotein，NP）和基质蛋白（Matrix，M）的特性，流感病毒被分为甲（A）、乙（B）、丙（C）和丁（D）4 个亚型[1]。每年甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）和乙型流感病毒（Influenza B virus，IBV）的流行均会引起严重的发病率和死亡率。与IAV 常导致的流感大流行暴发不同，IBV 是引起季节性流感的主要原因之一，常常引起局部暴发流行[2]。在2011/2012 年和2015/2016 年的中国流感季节，53.7%和52.2%的流感病例由IBV感染造成。IBV 感染引起的呼吸系统症状较轻，但IBV 会倾向于感染儿童及老人并带来多种并发症，包括神经系统疾病、肌肉疾病和心脏疾病等[3-4]。IBV 无亚型的区分，根据病毒HA 基因抗原性的差异分为Victoria 和Yamagata 两个谱系。在过去的10年里，这两系病毒常交替作为优势株共存[5]。

目前，常用于检测流感病毒的方法有病毒分离培养法、血清学方法、分子生物学方法和免疫学方法，在以上检测方法中，酶联免疫吸附试验（ELISA）因具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优点，已经广泛应用于人畜疾病的检测[6-7]。本研究选择IBV 高度保守的核蛋白NP 作为靶抗原，以制备的病毒NP 蛋白单克隆抗体（Monoclonal antibodies，MAb）为基础建立双MAb 夹心ELISA 方法可以快速检测IBV，与本实验室研发的IAV NP 蛋白双MAb 夹心ELISA 检测方法配套实验可用于流感的早期诊断。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及实验动物pCAGGS-GSTIBVYmPJ18NP、pCAGGS-IBVYmPJ18NP、pCAGGS-IBVVcLN18NP、pCAGGS-GST-IBVYmPJ18NPmut1、CAGGS-GST-IBVYmPJ18NP mut2 质粒由本实验室构建保存；HEK293T 细胞、SP2/0 细胞均由本实验室保存；A/WSN/1933（H1N1）、B/Yamagata/PanJin/2018、B/Victoria/LiaoNing/2018、新城疫病毒（NDV）、马传染性贫血病毒（EIAV）、马疱疹病毒（EHV）、马动脉炎病毒（EAV）、IBVYmPJ18株、IBVVcLN18株由本实验保存；SPF 级BALB/c 小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司；70 份人咽拭子样品由本实验-80 ℃保存。

1.2 主要试剂96 孔聚乙烯酶标板购自Costar 公司；抗体纯化试剂盒购自GE Healthcare 公司；QuickAntibody-Mouse3W（3 周标准鼠单抗/多抗制备佐剂）购自北京博奥龙免疫技术有限公司；TMB 显色液购自Abcam 公司；预染蛋白Marker 购自Thermo Scientific 公司；碱性细胞裂解液由本实验室配置；GST 标签蛋白纯化试剂盒、PreScission Protease 购自上海碧云天生物技术有限公司；红外荧光标记的羊抗鼠IgG（IgG-Dylight 800）购自Sigma 公司；Influenza B virus Nucleoprotein antibody 购自Gene Tex公司；PolyJetTMin Vitro DNA transfection reagent购自SignaGen公司。

1.3 IBVYmPJ18NP 蛋白的制备和纯化在75 cm2细胞培养瓶中培养HEK293T 细胞，14 h～16 h 后待细胞密度达80%时用PolyJet 转染试剂转染12 μg pCAGGSGST-IBVYmPJ18NP 质粒，8 h 后更换细胞培养液，24 h后加入碱性裂解液裂解细胞，12 000 r/min 离心10 min 去除细胞碎片收集细胞裂解液上清。利用GST 标签蛋白纯化试剂盒和HRV 3C 蛋白酶纯化IBVYmPJ18NP 蛋白，经SDS-PAGE 检测蛋白的纯化效果。紫外分光光度计测定蛋白浓度，分装冻存于-80 ℃。

1.4 鼠抗NP MAb 的制备、纯化和HRP 标记将IBVYmPJ18NP 蛋白和QuickAntibody-Mouse3W 快速佐剂等体积预混液作为免疫原，实验动物选用6 周龄BALB/c 雌性小鼠，免疫程序为3 周2 次快速免疫，每只小鼠每次肌肉注射20 μg IBVYmPJ18NP 蛋白，加强免疫每只小鼠腹腔注射100 μg IBVYmPJ18NP 蛋白，杂交瘤细胞融合，获得单克隆杂交瘤细胞。HEK293T细胞转染pCAGGS-GST-IBVYmPJ18NPmut1、 pCAGGSGST-IBVYmPJ18NPmut2 质粒，通过western blot 筛选出不同抗原表位的杂交瘤细胞扩大培养，小鼠腹腔注射，收获小鼠腹水。利用HiTrap Protein G HP 抗体纯化柱纯化MAb 并测定浓度，选取抗原表位长、特异性强的MAb 作为捕获抗体，加入50%甘油于-80 ℃保存；选取抗原表位短、灵敏度高的MAb 作为检测抗体，由钟鼎生物公司进行HRP 标记。

1.5 双MAb 夹心ELISA 方法的建立利用方阵法对包被的捕获抗体浓度（0. 01 μg/孔、0.1 μg/孔、1 μg/孔）、捕获抗体反应时间（4 ℃过夜、37 ℃1 h、37 ℃2 h）、封闭液及其浓度[3%FBS、5%FBS、3%BSA（牛血清白蛋白）、5%BSA、3% 脱脂奶粉、5%脱脂奶粉]、封闭时间（37 ℃0.5 h、37 ℃1 h、37 ℃1.5 h、37 ℃2 h、37 ℃2.5 h、37 ℃3 h）、抗原反应时间（37 ℃0.5 h、37 ℃1 h、37 ℃1.5 h、37 ℃2 h、37 ℃2.5 h、 37 ℃3 h）、 检 测 抗 体 的 稀 释 度（1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000）、检测抗体反应时间（37 ℃0.5 h、37 ℃1 h、37 ℃1.5 h、37 ℃2 h、37 ℃2.5 h、37 ℃3 h）、TMB 显示时间（1 min、5 min、10 min）进行优化。采用优化后的反应条件检测起始浓度为0.2 mg/mL 的IBVYmPJ18NP 蛋白并将其2 倍倍比稀释（2 倍～212倍），以OD450nm值为横坐标，对应NP 蛋白浓度为纵坐标，绘制NP 蛋白标准曲线；测定IBVYmPJ18病毒样品中NP 蛋白的含量并以该IBVYmPJ18病毒样品为标准品绘制病毒样品NP 蛋白的标准曲线。

1.6 阴阳性临界值的确定按照本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方法检测经荧光定量PCR（qPCR）方法（参考WS 285-2008 流行性感冒诊断标准）检测为阴性的人咽拭子样品30 份。参照文献[8]计算S/P值，S/P 值=（样品OD450nm-阴性样品OD450nm）/（阳性样品OD450nm-阴性样品OD450nm），计算各样品S/P 值的平均值和标准方差SD，当样品S/P 值＜+2SD 时，判为阴性；样品S/P 值＞-X+3SD 时，判为阳性；+2SD≤样品S/P 值≤-X+3SD 时，判为疑似。

1.7 双MAb 夹心ELISA 方法的评估

1.7.1 特异性试验 采用本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方法分别对H1N1WSN、IBVYmPJ18、NDV、EIAV、EHV、EAV 进行检测，根据S/P 值对该方法的特异性进行评价。

1.7.2 灵敏度试验 将血凝滴度为6log2 的IBVYmPJ18上清液2 倍倍比稀释（2 倍～27倍），利用优化后的双MAb 夹心ELISA 方法进行检测，根据S/P 值判定阴阳性结果，根据标准曲线方程求出阴阳性结果的病毒NP 蛋白浓度，评价该方法的灵敏度。

1.7.3 广谱性试验 采用本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方法分别检测IBV 的YmPJ18株和VcLN18株两个不同谱系的病毒上清液，同时HEK293T 细胞转染pCAGGS-IBVYmPJ18NP、pCAGGS-IBVVcLN18NP，8 h 后更换细胞培养液，24 h 后孵育1.4 中筛选到的两株MAbs（1∶2 000）和商品化Influenza B virus Nucleoprotein antibody（1∶2 000），以红外荧光标记的羊抗鼠IgG（IgG-Dylight 800）（1∶5 000）为二抗，经western blot 检测NP 蛋白的表达。评价本研究建立的双MAb夹心ELISA 方法广谱性。

1.7.4 重复性试验 取同一批次包被抗体的ELISA板，按优化后的双MAb 夹心ELISA 方法检测6 份病毒样品，试验设置5 个重复，测定OD450nm值，计算批内变异系数。取不同批次包被抗体的ELISA 板，按优化后的双MAb 夹心ELISA 方法检测同样6 份病毒样品，试验设置5 个重复，测定OD450nm值，计算批间变异系数。评价本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方法的重复性。

1.8 抗体稳定性加速试验将捕获抗体提前包被到酶标板并封闭好，分别置于25 ℃和37 ℃保存，利用本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方法按时间次序分别检测IBVYmPJ18病毒标准品，以标准品中OD450nm趋近于1 的值为参照，评价温度对该双MAb 夹心ELISA 方法捕获抗体的影响。

1.9 临床样品检测利用本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方法检测40 份人咽拭子样品，根据S/P 值判定检测结果；同时提取样品核酸，采用qPCR 方法（参考WS 285-2008 流行性感冒诊断标准）对样品进行检测。将两种方法的检测结果进行比较，并计算二者的符合率。评价该双MAb 夹心ELISA 方法检测的准确性。

2 结 果

2.1 IBVYmPJ18NP 蛋白的制备和纯化将pCAGGSGST-IBVYmPJ18NP 重组质粒转染至HEK293T 细胞经表达并纯化后，SDS-PAGE 检测结果显示纯化蛋白大约为62 ku，与预测蛋白大小相符（图1），纯度达95%以上，紫外分光光度计测定蛋白浓度为1 mg/mL。

图1 NP 蛋白的SDS-PAGE 检测Fig.1 NP protein detection by SDS-PAGE

2.2 鼠抗NP MAb 的制备、纯化和HRP 标记本试验共进行3 次克隆纯化，通过western blot 筛选出2株不同抗原表位的单克隆细胞（图2）并扩大培养，注射小鼠腹腔，获得2 株MAbs（2B3-5 和3C3-7），2B3-5 可识别NP 蛋白第aa48 之后的序列、3C3-7 可识 别NP 蛋 白aa25～aa48 序 列。2B3-5 作 为 捕 获抗体，纯化后稀释至抗体浓度为2 mg/mL。3C3-7作为检测抗体，纯化后进行HRP 标记，终浓度为0.85 mg/mL。

图2 2 株MAbs 抗原表位的western blot 鉴定结果Fig.2 Western blot identification of MAbs epitopes in 2 trains

2.3 双MAb 夹心ELISA 方法的建立经优化该双MAb 夹心ELISA 方法的最佳反应条件为：捕获抗体0.1 μg/孔，4 ℃包被过夜；3%BSA 37 ℃封闭2 h；待检抗原37 ℃孵育2 h；检测抗体1∶4 000 稀释，37 ℃反应1 h；TMB 室温显示5 min 测定OD450nm值。蛋白标准品在3.9 ng/mL～62.5 ng/mL 时呈良好的线性关系，标准曲线为y=47.13x-1.662，R2=0.9973（图3A）。IBVYmPJ18病 毒 标 准 品 在3.3 ng/mL～53.0 ng/mL 时 呈 良 好的线性关系，标准曲线为y=47.169x-2.6132，R2=0.9973（图3B）。

2.4 阴阳性临界值的确定采用本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方法检测30 份人咽拭子阴性样品，计算S/P 值，得出S/P 值的平均数-X=0.152，S/P 值的标准方差SD=0.028。-X+2SD=0.209，-X+3SD=0.237。当样品S/P 值＜0.209 时，判为阴性；当样品S/P 值＞0.237 时，判为阳性；当0.209≤样品S/P 值≤0.237时，判为疑似。

图3 双MAb 夹心ELISA 标准曲线Fig.3 Standard curve of the double-monoclonal antibody sandwich ELISA assay

2.5 双MAb 夹心ELISA 方法评估

2.5.1 特异性试验 采用本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方 法 检 测H1N1WSN、IBVYmPJ18、NDV、EIAV、EHV、EAV。结果显示，除IBVYmPJ18S/P 值为1.01，其余病毒的S/P 值均在0.2 以下（图4），无交叉反应，表明该检测方法特异性较强。

图4 双MAb 夹心ELISA 特异性试验结果Fig.4 Specificity test of the double-monoclonal antibody sandwich ELISA assay

2.5.2 灵敏度试验 利用优化后的双MAb 夹心ELISA 检测方法对2 倍倍比稀释的IBVYmPJ18上清液进行检测，结果显示当病毒稀释64 倍时，即病毒NP 蛋白浓度为13.26 ng/mL 时根据判定标准为阳性结果（S/P 值＞0.237），当病毒稀释为128 倍时，即病毒NP蛋白浓度为6.63 ng/mL 时为阴性结果（S/P 值＜0.209），因此该MAb 夹心ELISA 方法对病毒NP 蛋白的最低检测浓度为13.26 ng/mL（图5），表明该检测方法特敏感性较高。

图5 双MAb 夹心ELISA 灵敏度试验结果Fig.5 Sensitivity test of the double-monoclonal antibody ELISA assay

2.5.3 广谱性试验 采用本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方法检测IBV 两个不同谱系病毒上清液，结果显示该双MAb 夹心ELISA 方法可以检测两个谱系IBV，并且对病毒定量无较大差异（图6A）；western blot 结果也显示，该双MAb 夹心ELISA 方法的两株MAb 能很好的识别Ym 和Vc 两个不同谱系的NP 蛋白（图6B）。表明本研究建立的IBV双MAb夹心ELISA方法有较好的广谱性，能适用于通用性IBV的检测。

2.5.4 重复性试验 利用同一批次抗体包被ELISA板检测样品，结果显示，批内变异系数为3.155%～7.512%。用不同批次抗体包被的ELISA 板检测样品，结果显示，批间变异系数为1.375%～6.622%（表1）。批内和批间变异系数均小于8%。表明该方法重复性较好，稳定性较高。

2.6 抗体稳定性加速试验利用本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方法在不同温度下对病毒标准品的检测，结果显示该方法的捕获抗体可以在25 ℃和37 ℃的高温下保存4 d，而抗体的ELISA OD450nm仅下降至50%（图7）。表明该抗体可以在高温条件下保存较长时间，该双MAb 夹心ELISA 方法的捕获抗体具有很好的热稳定性。

2.7 临床样品检测采用本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方法和qPCR 方法同时检测40 份人咽拭子样品，结果显示本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方法检测出18 份IBV 阳性样品，22 份IBV 阴性样品，qPCR 方法检测出30 份IBV 阳性样品，10 份IBV 阴性样品。该MAb 夹心ELISA 方法与qPCR 方法的总符合率为70%。表明本研究建立的双MAb夹心ELISA方法可以有效的检测IBV，但检出率不及qPCR 高。

图6 双MAb 夹心ELISA 广谱性试验结果Fig.6 The broad-spectrum test of the double-monoclonalantibody sandwich ELISA assay

表1 双MAb 夹心ELISA 重复性试验结果（n=6）Table 1 Peproducibility test of the double-monoclonalantibody sandwich ELISA assay(n=6)

图7 双MAb 夹心ELISA 抗体稳定性加速试验结果Fig.7 Antibody accelerated stability results of sandwich antibody ELISA assay

3 讨 论

IBV 曾引起16 次流感局部暴发和流行，感染后发病率和死亡率较高，多发于儿童及青少年[9-10]。2007 年入冬以来，以Yamagata 谱系为主的IBV 与IAV 中的H1N1、H3N2 亚型流感在我国区域流行，IBV 在我国很多地区成为了引起流感发生的优势流行株，严重影响人们的健康[11-13]。本研究建立的IBV NP 蛋白ELISA 检测方法，对于IBV 的临床诊断以及流行病学研究具有重大意义。

本研究选择IBV 高度保守的NP 蛋白作为靶点，利用GST 标签真核表达纯化系统纯化IBV NP 蛋白。利用真核表达系统表达重组蛋白优于原核系统表达的蛋白[8]，在构象上更接近于天然蛋白，对免疫效果及获得抗天然蛋白抗原表位的MAb 至关重要。本研究在动物免疫过程中使用快速免疫佐剂，21 d 完成免疫程序，减少NP 蛋白的免疫用量，缩短制备抗体时间。通过western blot 筛选获得两株针对不同抗原表位的高亲和力MAb，配对建立双MAb 夹心ELISA 方法。该双MAb 夹心ELISA 检测方法可以特异性检测IBV，与IAV、NDV、EIAV、EHV、EAV 无交叉反应。该双MAb 夹心ELISA 方法对IBV NP 蛋白的最低检测浓度为13.26 ng/mL，在筛选抗原表位时我们发现NP 蛋白的aa25～aa48 序列更容易被B 淋巴细胞识别，相比于NP 蛋白的其他氨基酸序列具有更好的免疫原性，能与B 淋巴细胞通过抗原-抗体结合过程产生高亲和力抗体，而NP 蛋白的aa48 之后的氨基酸序列则免疫原性差，不容易被B 淋巴细胞识别，产生抗体亲和力相对较低。所以筛选到的31 株单克隆细胞中，有29 株细胞的抗原表位为NP蛋白的aa25～aa48 序列，只有2 株细胞的抗原表位为aa48 之后的序列。所以本研究建立的IBV NP 蛋白双MAb 夹心ELISA 检测方法的灵敏度因为抗体亲和力差异比本实验室研发的IAV NP 蛋白双MAb 夹心ELISA 检测方法的灵敏度稍差。用该双MAb 夹心ELISA方法与qPCR 方法同时检测40 份人咽拭子样品，二者的符合率为70%。qPCR 方法虽特异性强、敏感性高，但qPCR 方法对实验环境要求较高，容易出现假阳性结果，一旦发生气溶胶污染很难清除。而本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方法灵敏度虽不及qPCR 检测方法高，但该MAb 夹心ELISA 检测方法操作简单快捷、对实验人员和设备要求低、花费成本低。并且还可以利用亲和素-生物素-过氧化物酶系统对该方法再次进行优化，将亲和素标记到过氧化物酶上再与生物素化的抗体接触时可以将微量抗原的信号放大成千上万倍，有助于提高检测灵敏度，比普通ELISA 敏感4～16 倍，可以用于基层对IBV 的临床检测。该双MAb 夹心ELISA 方法的捕获抗体热稳定性好，可以在25 ℃和37 ℃高温条件下保存较长时间，方便抗体的长期贮存和长途运输及以该双MAb 夹心ELISA 方法制成商品化ELISA 试剂盒的运输和保存，可以降低生产和运输成本。而且目前我国虽建立了多种ELISA 检测流感的方法，但几乎均停留在实验室研究阶段，商品化ELISA 流感检测试剂盒还很少，而本研究建立的双MAb 夹心ELISA 方法可用于临床检测。

综上所述，本研究建立的双MAb 夹心ELISA 流感病毒检测方法操作简单、成本低廉、灵敏度高，具备潜在的应用价值，可以为流感病毒的快速检测提供有力的技术支持。