细菌鞭毛蛋白免疫佐剂活性作用机制及应用研究进展

庞胜美，吴文文，丁雪燕，刘思国，王晓钧，段强德*，朱国强*

（1. 扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；3. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

鞭毛是位于细菌表面的一种长丝状附属物，由基体部（Basal body）、鞭毛钩（Hook）和鞭毛丝（Filament）3 部分组成，其中fliC 是鞭毛蛋白编码基因的主要结构成分。鞭毛蛋白是一种重要的病原体相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），能激活细胞表面Toll 样受体5（Toll-like receptor 5，TLR5）[1]和/或细胞溶质NOD 样受体蛋白4（NLR family CARD domain-containing protein 4，NLRC4）[2]，发挥免疫佐剂活性[3-4]。作为一种新型分子免疫佐剂，鞭毛蛋白可通过不同免疫形式和免疫途径同时诱导机体先天性免疫和获得性免疫反应。鉴于鞭毛蛋白能够辅助诱导有效的抗原特异性反来对抗不同的病毒和细菌等病原体，目前其已经较为广泛的应用于细菌、病毒和寄生虫等多种病原体的抗感染疫苗佐剂研发。同时，鞭毛蛋白免疫佐剂活性也为肿瘤疫苗及癌症免疫治疗的开发提供了新策略[5]。

1 细菌鞭毛蛋白的结构特点

对沙门氏菌鞭毛蛋白的晶体结构研究显示，其全长由495 个氨基酸残基组成，包括4 个线性相关的结构域：两个高度保守的核心结构域（D0、D1）和两个超变结构域（D2、D3）[6]。鞭毛蛋白NH2-端和COOH-端链形成α 螺旋结构，组成了位于鞭毛丝中心的D0 和D1 结构域；而可变区形成β 折叠结构，组成了位于鞭毛丝外表面的D2 和D3 结构域（图1）。鞭毛蛋白不同结构域分别发挥不同的作用。鞭毛蛋白D0 结构域在不同种属细菌中高度保守，是由鞭毛蛋白NH2-端和COOH-末端的50 个氨基酸共同组成。D0 结构域中位于第aa89～aa96 位氨基酸残基关键位点对TLR5 信号识别传导尤为重要，而位于其COOH末端最后35个氨基酸与其介导的NLRC4受体信号传导相关[7-8]。D1结构域由位于NH2-末端第aa56～aa176位氨基酸残基以及位于COOH-末端第aa402～aa450 位氨基酸残基共同组成。其中位于NH2-端的第aa90～aa97位氨基酸（QRVRELAV）形成高度保守的基序，该基序与鞭毛蛋白高亲和力结合TLR5 以及激活TLR5 的信号传导途径密切相关。D2结构域由位于NH2-端第aa177～aa189 和COOH 端第aa284～aa401 位氨基酸残基共同组成，形成两个短螺旋β-链，两端分别连接D1 和D3 结构域。D2 结构域可能是髓样分化蛋白88（Myeloid differential protein-88，MyD88）非依赖性IgG1 抗鞭毛蛋白反应中最关键的结构域[9]。D3 结构域由第aa190～aa283 氨基酸残基组成，主要是一段短螺旋折叠的β-链。D3 结构域决定鞭毛蛋白的各种H抗原亚型，该结构域与鞭毛蛋白免疫原性相关，同时对维持鞭毛细丝稳定性也发挥着重要作用[10]。总之，明晰鞭毛蛋白各个结构域的结构特点，可以为进一步研究它们的功能提供重要信息。

图1 沙门氏菌鞭毛蛋白的结构示意图

2 鞭毛蛋白的免疫佐剂活性及其机制

鞭毛蛋白可以通过激活细胞表面的TLR5 途径和/或胞内NLRC4 途径，诱导机体促炎因子的产生，激发机体的先天性免疫反应，从而发挥其免疫佐剂活性（图2）。TLR5 表达于多种细胞上，包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞（DC）、上皮细胞和淋巴结（LN）基质细胞等[12-13]。这些免疫细胞通过TLR5 同源二聚体或异源二聚体（TLR4/TLR5）复合物，识别胞外的鞭毛蛋白单体，从而诱导产生促炎细胞因子、一氧化氮（NO）、H2O2、趋化因子和宿主防御蛋白等[14]。促炎因子进一步通过激活共刺激分子和粘附分子信号通道而促进机体的获得性免疫应答[15]。鞭毛蛋白TLR5 信号途径的激活包括MyD88 依赖性途径或MyD88 非依赖性途径。MyD88 依赖性途径首先是鞭毛蛋白与细胞表面TLR5 结合诱导TLR5 的二聚化。然后，MyD88 被招募到TLR5 的细胞质部分并与之结合，随后通过白细胞介素-1 受体相关激酶（Interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK）、肿瘤坏死因子受体活化因子6（TNF receptor-associated factor，TRAF6）和TGF-β 相关激酶1（TGF-β associated kinase 1，TAK1）将信号传递给有丝分裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）和IκB激酶级联反应，从而诱导下游炎症相关基因的表达。MyD88非依赖性途径则首先是TLR4/TLR5异二聚体通过干扰素应答因子3（Interferon response factor 3，IRF3）途径诱导IFN-β 的产生，进一步激活信号转导与转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，Stat1）促进诱导型一氧化氮合酶（Inducible NO synthase，iNOS）基因转录，并生成NO[16-17]。

图2 鞭毛蛋白调节机体免疫系统的机制图[22]

除了激活胞外TLR5 信号通路外，鞭毛蛋白还可以激活胞质内NLRC4 信号通路[18]。核苷酸结合和寡聚化结构域样受体（Nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptor，NLR）通常包含3 个结构域：NH2-端的Caspase 募集结构域（CARD）、中央的核苷酸结合寡聚结构域（Nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）和COOH 端的富含亮氨酸重复序列（Leucine rich repeat，LRR）结构域。进入胞质中的鞭毛蛋白首先与NLR 家族的两个受体凋亡抑制蛋白5 和6（NLR apoptosis-inhibitory proteins 5 and 6，NAIP5 和NAIP6）结合形成复合物，复合物随后与NLRC4 结合，分泌炎性小体，进一步激活Caspase-1信号通道，促进IL（Interleukin）-1β 和IL-18 的加工和分泌[19-20]，从而发挥鞭毛蛋白的免疫活性。NLRC4 的激活还可通过多种途径调节机体的获得性免疫应答，但是其具体分子机制目前尚不清楚[21]。

TLR5 与NLRC4 信号通路除了分别介导鞭毛蛋白的宿主免疫应答外，该两个信号通路之间也能相互调节[23]。研究显示，鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白第aa89～aa96 位氨基酸残基突变后，鞭毛蛋白不仅与TLR5 和NLRC4 受体结合能力降低，而且其免疫佐剂活性也显著降低[24]，这表明该基序既是TLR5 识别的关键位点，同时也是鞭毛蛋白发挥免疫佐剂活性的关键位点。当TLR5 信号通道受阻时，鞭毛蛋白还可通过NLRC4 信号通道激活机体的先天性免疫反应[25]。此外，研究显示TLR5 活性降低会伴随着NLRC4 的信号降低，进而降低鞭毛蛋白的佐剂活性[24]；而NLRC4 信号通道的激活则可以负调控鞭毛蛋白TLR5 信号通道介导的免疫应答[7]。

虽然鞭毛蛋白作为一种高效的免疫佐剂，可通过TLR5 和NLRC4 信号通路诱导机体的先天性免疫应答和获得性免疫应答。但目前尚不清楚TLR5 和/或NLRC4 信号通道的激活对宿主防御细菌感染的作用效果和具体作用机制。因此，进一步研究TLR5和NLRC4 信号通路之间的相互作用，将有助于增强对鞭毛蛋白介导机体的先天性免疫应答复杂机制的理解，并设计出基于鞭毛蛋白的更为合理、高效的疫苗。

3 鞭毛佐剂的临床应用

鉴于细菌鞭毛蛋白的生物学特性，其作为新型分子免疫佐剂，具有诸多的优势。首先，传统铝胶油乳佐剂主要是诱导机体产生体液免疫反应，而鞭毛蛋白可以同时诱导机体的体液免疫和细胞免疫反应[21,26]。其次，由于其结构的特殊性，可以在其NH2 端、COOH 端或中间的高变区插入外源抗原，而不影响其结构和功能[27]。再次，鞭毛蛋白和外源抗原的融合表达可以保证抗原-佐剂递送至相同的表达TLR5 的抗原递呈细胞（APC），从而显著增强机体的免疫应答水平。此外，由于鞭毛蛋白本身的免疫佐剂活性特性，鞭毛蛋白和外源抗原作为融合蛋白表达还可以大大减少疫苗生产时间、免疫佐剂用量，从而节约生产成本[28]。

鞭毛蛋白作为一种极具吸引力的新型免疫佐剂，可以与外源抗原以多种形式结合，以增强抗原的免疫效果。在某些情况下，鞭毛蛋白和抗原混合接种机体，可以同时诱导针对外源抗原和鞭毛蛋白的免疫反应[29-30]。如将鼠疫耶尔森氏菌的YopE 基因与沙门氏菌鞭毛蛋白基因fliC 混合免疫，比单独免疫鼠疫耶尔森氏菌的YopE 基因诱导机体更强烈的体液和细胞免疫应答，对小鼠提供的保护率达到83%，而单独接种YopE 对小鼠仅提供50%的保护率[31]。用轮状病毒保守的VP6 抗原与鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白fliC 基因混合免疫小鼠，只需要低水平的鞭毛蛋白表达就可以显著预防新生小鼠感染轮状病毒，保护率可以达80%[32]。但有时需要将外源抗原与鞭毛蛋白融合表达才能诱导有效的免疫反应[33]。由于鞭毛蛋白具有优良的可塑性，可以将鞭毛蛋白基因fliC 与抗原组合构建融合蛋白，而不会破坏各自独立的空间结构以及生物学活性。外源抗原可以与鞭毛蛋白NH2-端或COOH-末端连接，或者替换鞭毛蛋白的高变区。作为一种有效的抗原递呈载体，鞭毛蛋白与外源抗原蛋白融合表达，可以显著提高该抗原的免疫效果。例如将流感病毒的HA 抗原融合至鞭毛蛋白的NH2-端或COOH-末端，均能刺激机体产生强烈的体液和细胞免疫反应[34]。此外，将H5N1 亚型流感病毒的HA 球状头取代鞭毛蛋白的高变区构建融合蛋白，可以在免疫小鼠体内诱导产生强大、持久的中和抗体，保护小鼠抵抗H5N1 流感病毒感染可达8 个月以上[35]。Li 等人将猪流行性腹泻病毒（PEDV）的Spike（S）蛋白的胶原酶当量（COE）结构域替换重组沙门氏菌鞭毛蛋白的D3结构域，构建具有聚合能力和TLR5 激动剂活性的rSF-COE-3D 重组蛋白，不仅显著激发小鼠的局部黏膜、全身性体液和T 细胞免疫应答，而且还显著提高针对PEDV 的中和抗体滴度[36]。与将鞭毛蛋白和目的抗原混合接种机体相比，将目的抗原与鞭毛蛋白融合表达更有利于抗原和佐剂同时传递给表达TLR5 的宿主抗原递呈细胞（DCs），从而提高抗原的递呈效率，增强机体的免疫反应[26]。鉴于目的抗原-鞭毛蛋白融合蛋白可以通过TLR5 信号通路更好的激活DCs，因此这种融合形式可能成为构建疫苗的一种更优的策略。

鞭毛蛋白作为免疫佐剂，不论是通过口服途免疫径还是注射免疫途径，均能发挥其免疫佐剂活性，诱导机体产生强烈的免疫反应[37-38]。细菌鞭毛蛋白可以激活黏膜组织中表达TRL5 的免疫细胞，从而发挥其黏膜佐剂活性，以诱导机体产生保护性抗体[39-40]。目前，鞭毛蛋白作为一种有效的黏膜佐剂已经应用于新城疫[41]、流感[42]、痘病毒病[43]、艰难梭菌病[44]和恶性疟原虫病[45]等疫苗的研发。

此外，鞭毛蛋白以不同的注射方式免疫时，也均能发挥其免疫佐剂效应。如将UPECI89 I 型菌毛黏附亚单位的fimH 基因和CFT057 鞭毛蛋白的flic 基因融合表达，将该融合蛋白经皮下注射途径免疫小鼠可以诱导其高水平的体液免疫和细胞免疫反应，并且显著减少了尿道致病性大肠杆菌（UPEC）在小鼠膀胱中的定植[46]。将狂犬病病毒的病毒样颗粒（VLPs）与鞭毛蛋白基因fliC 的NH2-端嵌合，利用基因工程技术融合表达，通过肌肉注射小鼠或犬，均能够快速诱导产生狂犬病病毒的中和抗体，并激发大量的CD4+T 和CD8+T 细胞反应，抵抗狂犬病病毒的感染[47]。此外，将缺失高变区的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白（STF2Δ）融合西尼罗河病毒（WNV）的包膜（E）蛋白EIII 结构域，将该嵌合蛋白（STF2D.EIII）经腹腔注射小鼠，能够诱导小鼠持久有效的WNV-EIII 特异性IgG抗体反应，从而有效地抵抗WNV 的感染[48]。

鞭毛蛋白作为免疫佐剂除较为广泛地应用于常见的抗细菌、病毒和寄生虫等多种不同病原体感染，最近研究还显示鞭毛蛋白在抗肿瘤、抗辐射、治疗药物成瘾、I 型过敏反应等方面同样发挥着重要的作用，但是其具体的作用机制尚不明确[49-51]。

虽然鞭毛蛋白作为免疫佐剂在实验室取得了很好的效果，但是目前其在临床应用上仍有一定的局限性。一方面由于鞭毛蛋白的内在抗原性，鞭毛蛋白作为免疫佐剂能够诱导针对其自身的特异性抗体，从而中和其触发的先天性免疫的应答能力，进而影响其免疫佐剂活性。另一方面，鞭毛蛋白是一些病原菌重要的毒力因子，可能会加剧一些疾病进程。已有研究表明，鞭毛蛋白的表达与肠道炎症、肺部损伤等炎症性疾病相关[52-53]。因此，进一步深入研究鞭毛蛋白发挥免疫佐剂活性的分子机制对于其的临床应用有重要意义。目前普遍认为，合理降低鞭毛蛋白的剂量、构建融合蛋白或者将鞭毛蛋白与其他TLR 激动剂或NLRs 联合使用可以有效减少甚至避免这些副作用，从而更好地发挥其佐剂效应[22]。

4 小结与展望

鞭毛蛋白是PAMP 中重要的成员之一，是天然免疫细胞对病原体特异性识别的分子基础。作为一种新型的分子免疫佐剂，鞭毛蛋白的多结构域赋予了其N 端或C 端以及高变区与抗原融合的特性，通过激活胞外的TLR5 途径和/或胞内的NLRC4 途径，进而激活机体的先天性和适应性免疫应答。鞭毛蛋白可以通过多种免疫形式和免疫途径增强与其共同免疫的外源抗原的免疫原性，目前细菌鞭毛蛋白作为免疫佐剂已经广泛应用于细菌、病毒和寄生虫等多种疾病疫苗的研发。除了作为疫苗佐剂外，鞭毛蛋白在抗肿瘤、抗辐射和治疗药物成瘾等方面也取得较好的研究进展。但是，市场上目前还没有批准可使用或销售的鞭毛蛋白佐剂疫苗，只有重组鞭毛蛋白-流感疫苗已经进入II 期临床试验，免疫结果显示该疫苗具有良好的免疫原性、耐受性和安全性[54]。本实验室正在探究不同血清型的细菌鞭毛蛋白以及鞭毛蛋白不同结构域免疫佐剂活性能力的差异性，研究结果表明不同血清型大肠杆菌的鞭毛蛋白在体外和体内具有相同的免疫佐剂活性；而对鞭毛蛋白不同结构域免疫佐剂活性的研究表明，鞭毛蛋白体外TLR5 受体活性需要完整的鞭毛蛋白结构（数据未发表）。后续将要在体内进一步验证上述结果。随着对鞭毛蛋白发挥免疫佐剂活性机制的深入阐释，将来会有更多的基于鞭毛蛋白为佐剂的疫苗进入实际应用中。另外，以鞭毛蛋白某一结构域或特定功能氨基酸残基位点作为新型分子佐剂也值得关注和研究。