牛星状病毒和牛诺如病毒双重PCR 检测方法的建立及应用

王文佳，邓廷贤，徐照学，张 彬，孟红丽，王亚州，兰亚莉*，师志海*

（1. 河南牧业经济学院动物医药学院，河南 郑州 450046；2. 河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；3. 中国农业科学院水牛研究所，广西 南宁 530001）

星状病毒（Astrovirus，AstV）是单股正链无囊膜的RNA 病毒，有2 个病毒属：哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus）和禽星状病毒属（Avastrovirus），分别感染哺乳动物和禽类[1]。1978 年，在英国急性腹泻的犊牛粪便中首次发现牛星状病毒（Bovine astrovirus，BAstV）[2]，随后，苏格兰[3]、日本[4]、加拿大[5]等也相继报道了BAstV。BAstV 感染会引起犊牛腹泻，且常与其它腹泻病原，如牛轮状病毒（Bovine rotavirus， BRoV）， 牛 环 曲 病 毒（Bovine torovirus，BToV），尤其是牛诺如病毒（Bovine norovirus，BNoV）等共感染，增加疾病的严重性。近年来BAstV 感染可引起牛发生脑炎，出现神经性疾病[6]，因此BAstV感染越来越受到重视。

BNoV 是杯状病毒科、诺如病毒属的单股正链RNA 病毒，是引起新生犊牛腹泻的主要病毒性病原之一[7]。1978 年，BNoV 在英国急性腹泻犊牛的粪便中首次被发现[2]，我国于2017 年首次在腹泻犊牛粪便中检测出该病毒[8]。诺如病毒有6 个基因群[9]，BNoV 属于GIII 群，其中BNoV 又细分为2 个基因型，分别是以Bo/Jena/80/DE 株为代表的基因1 型和以Bo/Newbury2/76/UK 株为代表的基因2 型[10]，目前我国普遍流行的是基因1 型BNoV。BNoV 感染犊牛后常引起腹泻、厌食和消化不良，3 周龄犊牛比新生犊牛症状严重。我国对BAstV 和BNoV 的相关报道较少，另外二者在犊牛腹泻中的作用还存在争议，有待于更多的研究求证。因此，本研究建立了同时检测BAstV 和BNoV 的双重PCR 方法，并检测了采集自河南省规模化牛场的腹泻粪便样品，为BAstV和BNoV 的早期临床检测和流行病学调查提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料BNoV、BAstV、BToV、BRoV、牛冠状病毒（Bovine coronavirus，BCoV）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛嵴病毒（BovineKobuvirus，BKoV）cDNA 均由本实验室鉴定保存；221 份粪便样品采集自2017 年9 月～2019年5 月采集自河南省规模化养牛场出现腹泻症状的犊牛，犊牛月龄均为3 月龄以下；全部样品单独分装，详细记录牛的品种、年龄、采样日期、样品数量等信息，用冰袋带回实验室立即检测，或置-80 ℃保存。

MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、Prime-ScriptTMII1st Strand cDNA Synthesis Kit、克隆载体pMD18-T、大肠杆菌JM109 感受态细胞、2×Premix Taq、DL2000 DNA Marker 等购自TaKaRa 公司；胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自OMEGA 公司。

1.2 引物设计与合成根据GenBank 登录的BAstV ORF1a 基因（KJ620980）和BNoV RdRp 基因（NC029645）的保守序列，利用oligo6.0 软件分别设计2 对引物，预期扩增BAstV 片段大小为376 bp，上游引物AF1：GCACGTTCGTCCTCGATGT/下游引物AR1：ATACGT TTGGCCTCGCTCACA；扩增BNoV 片段大小为542 bp，上游引物NF1：GGCAAACCACGCAAACAAC/下游引物NR1：CTTCCGAAAGGGCACAGA。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 单一PCR 的扩增以BAstV 和BNoV 的cDNA为模板，分别进行各自单一PCR 扩增，扩增体系为20 μL：模板cDNA 2 μL，2×Premix Taq 10 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），ddH2O 补足20 μL；扩增程序为：94 ℃5 min；94 ℃40 s、52 ℃40 s、72 ℃40 s，30 个循环；72 ℃5 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 重组质粒标准品的构建与鉴定利用胶回收试剂盒分别回收1.3 中扩增的目的条带，克隆于pMD18-T载体，构建重组质粒pMD-BAstV 和pMD-BNoV，分别转化至E. coli JM109 感受态细胞，选取阳性克隆菌由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序正确的样品扩大培养后采用质粒提取试剂盒分别提取pMD-BAstV 和pMD-BNoV，用超微量核酸蛋白分析仪测定其浓度并换算为换贝数，分别作为双重PCR 反应的重组质粒标准品。

1.5 双重PCR 反应体系及条件的优化以pMDBAstV 和pMD-BNoV 的混合质粒为模板，采用方阵法分别对退火温度（50 ℃～55 ℃）、循环次数（25 次～35 次）、引物用量（0.2 μL～1 μL）、模板量（0.5 μL～4 μL）等进行优化，PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 特异性试验以BRoV、BToV、BCoV、BVDV、BKoV 的cDNA 为模板，分别以重组质粒pMD-BAstV、pMD-BNoV 以及二者的混合物为阳性对照，以ddH2O 为阴性对照，利用本研究建立的双重PCR 方法进行检测，以评估该方法的特异性。

1.7 敏感性试验采用ddH2O 对pMD-BAstV、pMDBNoV 进行10 倍倍比稀释，利用已优化的双重PCR方法和单一PCR 方法分别进行检测，设ddH2O 为阴性对照，以确定该方法的敏感性。

1.8 重复性试验利用所建立的双重PCR 方法分别进行批内和批间试验。批内试验：以拷贝数分别为1.09×106拷贝/μL 的pMD-BAstV 和1.42×106拷贝/μL的pMD-BNoV 为模板，一次试验做4 个重复；批间试验：不同时间段分别从阳性克隆菌JM109 中提取pMD-BAstV、pMD-BNoV 两种重组质粒，同一实验条件下分别进行4 次试验。以此确定检测结果的可靠性和重复性。

1.9 临床样品的检测用PBS 按1∶10（w∶v）分别混悬221 份粪便样品，漩涡震荡，4 ℃8000 r/min 离心5 min，收获上清，利用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit 提取病毒RNA，利用PrimeScriptTMII1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录获得cDNA，以其为模板，利用本研究建立的双重PCR 方法和单一PCR方法分别进行检测，比较两种方法的符合率，同时调查河南省腹泻犊牛BAstV 和BNoV 的感染情况。

2 结 果

2.1 重组质粒标准品的鉴定结果经测序鉴定正确的pMD-BAstV 和pMD-BNoV 重组质粒采用超微量核酸蛋白分析仪测定浓度分别为36.5 ng/mL 和50.3 ng/mL，经计算分别为1.09×1010拷贝/μL、1.42×1010拷贝/μL。

2.2 双重PCR 方法的构建及优化优化后的反应体系为20 μL：包括2×Premix Taq 10 μL，AF1、NF1 各0.5 μL（10 μmol/L），AR1、NR1 各0.5 μL（10 μmol/L），模板2 μL，ddH2O 补足20 μL；最佳反应条件为：94 ℃5 min；94 ℃30 s、52 ℃30 s、72 ℃40 s，30 个循环；72 ℃10 min。以pMD-BAstV 和pMD-BNoV 的混合重组质粒标准品、pMD-BAstV、pMD-BNoV 重组质粒标准品为模板，利用优化后的双重PCR 反应体系和条件进行扩增，以ddH2O 为阴性对照。结果显示，该方法可同时扩增出了约400 bp 和550 bp 的目的条带（图1），扩增的目的片段均经测序鉴定正确。表明本研究设计的引物能特异性地扩增出目的片段。

图1 双重PCR 扩增结果Fig.1 The amplification results of the duplex PCR

2.3 特异性试验结果利用已建立的双重PCR 反应方法对BRoV、BToV、BCoV、BVDV、BKoV 的cDNA 和重组质粒pMD-BAstV、pMD-BNoV 进行扩增，结果显示除重组质粒pMD-BAstV、pMD-BNoV 扩增出大小相符的目的片段外，其余病原均不能扩增出目的片段（图2），表明本研究建立的双重PCR 方法特异性强。

图2 双重PCR 方法的特异性试验结果Fig.2 Specificity assay of the duplex PCR

2.4 敏感性试验结果ddH2O pMD-BAstV 和pMDBNoV 重组质粒经10 倍倍比稀释（pMD-BAstV：1.09×107拷贝/μL～10.9 拷贝/μL；pMD-BNoV：1.42×107拷贝/μL～14.2 拷贝/μL）后作为模板，进行双重PCR 扩增。结果显示，该方法对BAstV 和BNoV 质粒标准品的检测下限分别为1.09×103拷贝/μL 和1.42×103拷贝/μL（图3），与单一PCR 方法对这两种质粒标准品的检测下限一致。表明本研究建立的双重PCR 方法敏感性高。

图3 双重PCR 方法的敏感性试验结果Fig.3 Sensitivityassay of the duplex PCR

2.5 重复性试验批内试验与批间试验结果均显示利用双重PCR 方法扩增出的条带亮度基本一致（图4），表明该方法具有良好的重复性。

2.6 临床样品检测利用本实验建立的双重PCR 方法与单一PCR 方法分别对221 份犊牛腹泻粪便样品进行检测，结果显示，BAstV 单一检出率为18.1%，BNoV 单一检出率为9.96%，BAstV 和BNoV 共感染的检出率为1.36%，表明河南省腹泻犊牛存在BAstV和BNoV 感染，且存在该两种病毒共同感染。将双重PCR 与单一PCR 对临床样品的检测结果进行对比分析，二者符合率为100%（表1）；表明本研究所建立的双重PCR 方法可用于BAstV 和BNoV 感染的临床检测及疾病的流行病学调查。

图4 双重PCR 的重复性试验结果Fig.4 Repeatability assay of the duplex PCR

表1 临床样品的检测结果Table 1 Detection of clinical samples

3 讨 论

随着规模化养殖业的迅速发展，动物疫病流行方式也在发生变化，尤其是病原的混合感染愈发严重。近年来随着我国养牛业的迅猛发展，犊牛腹泻和牛呼吸道疾病综合征等病症也成为困扰养牛业的难题，这可能与病原的种类增加、新发病原感染率高、混合感染严重等因素有关。

犊牛腹泻是犊牛尤其是30 日龄以下犊牛最为严重的常见疾病，会引起犊牛死亡，犊牛生长发育延缓，母牛初产年龄增大，疾病治疗和护理成本增加，给牛养殖业带来严重经济损失。2007 年美国动物健康监测系统指出57%的断奶前犊牛死亡都是由犊牛腹泻引起，如韩国[11]和伊朗[12]。星状病毒和诺如病毒是引起食源性疾病的主要病原。BNoV 感染犊牛后，可引起犊牛急性、间歇性、持续性腹泻[13]，严重者伴有肠上皮坏死和肠绒毛萎缩[14]，并可长期通过粪便排毒。BAstV 感染犊牛后，通常不会引起犊牛发生严重腹泻，但高达60%～100%的犊牛常呈隐性感染且可长期带毒[15]。近年来星状病毒被发现与人类脑炎有关，BAstV 感染引起牛发生脑炎的病例也相继被报道[6,16]，且存在星状病毒跨物种传播的可能[17]，应该引起人们重视。

作为最具代表性的现代检测和诊断新技术，PCR 技术一直被广泛应用，并衍生出多重PCR 等技术。多重PCR 技术与单一PCR 技术相比，不仅极大地缩短了临床混合感染病例的鉴别和诊断时间，还省时、省力、经济，对临床检测和诊断具有极高实用价值[18]。而BAstV 和BNoV 均属于RNA 病毒，这为建立双重PCR 方法提供了便利。目前关于BNoV 的检测方法鲜有报道，而能够同时检测BAstV 和BNoV的方法国内尚无相关报道。本研究分别以BAstV ORF1a 基因和BNoV RdRp 基因为靶标，设计了两对特异性引物，并通过对PCR 扩增体系和条件的优化，在国内首次建立了针对该两种病毒的双重PCR方法。试验结果表明该方法具有较强的特异性、高敏感性和良好的重复性，临床应用也表明该方法同样适用于大规模的病毒检测。其中对河南省规模化牛场的腹泻粪便样品检测结果显示，BAstV 和BNoV在河南省的牛场中已经存在，且存在同一犊牛共同感染BAstV 和BNoV 的情况。

本研究建立的BAstV 和BNoV 的双重PCR 检测方法，为这两种病毒感染早期的临床诊断和流行病学调查提供了技术支持，对这两种病毒混合感染及生物学关系的进一步研究具有重要意义。