澳洲墨瑞鳕源鱼假单胞菌的致病性及药敏特性研究

饶秋华，刘 洋，张志灯，罗 钦，何肖云，罗土炎*

（1. 福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/福建省农产品质量安全重点实验室，福建 福州 350003；2. 福州海关技术中心，福建 福州 350003）

假单胞菌属（Pseudomonas）广泛分布于土壤、淡水、海水以及生物体中，是一类生长适应能力较强的革兰氏阴性菌[1]，目前该属包含216 个已有效发布且名称正确的种（https://lpsn.dsmz.de/genus/pseudomonas）。假单胞菌属内部分菌株不仅是鱼、虾和甲壳类的病原菌，而且还极易引起人的急性腹泻和败血症，因此也是人鱼共患的病原菌[2]。常见的水产病害假单胞菌主要以铜绿假单胞菌[3]、恶臭假单胞菌[4]、荧光假单胞菌[5]、鳗败血假单胞菌和杀香鱼假单胞菌[6]等为主。

澳洲墨瑞鳕（Murray cod，Maccullochella peelii peelii）是国内近年兴起的养殖品种，原产于澳大利亚墨瑞河流域[7-8]，因其特殊的外形，鲜美的口感以及丰富的营养而备受广大消费者青睐[9]。但随着养殖集约化程度不断提高，养殖过程中澳洲墨瑞鳕的病毒病、寄生虫病及细菌病不断出现，而细菌则是其中分布范围最广泛、危害较严重的病原[10]。2018年3 月浙江省乐清市某养殖场内，澳洲墨瑞鳕出现头部皮肤褪色、溃烂，部分养殖池出现大量死亡，死亡率达60%。解剖发现，病鱼鳃部充血，部分鱼有腹水，部分内脏有充血病变症状。本实验室前期在患病澳洲墨瑞鳕头部溃疡处分离了一株鱼假单胞菌（Pseudomonas piscis）MC042[11]，本研究进一步分析菌株MC042 的基因进化地位，同时进行回归感染试验及其对30 种抗菌药物敏感性试验，旨在为由该菌引起澳洲墨瑞鳕细菌性疾病的有效防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料鱼假单胞菌MC042 为本实验室前期分离[11]。胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）和胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）购自广州环凯微生物科技有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒、PCR相关试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；试验中所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 16S rRNA 基因扩增和看家基因串联系统发育树构建利用细菌基因组DNA 试剂盒提取MC042 菌株基因组DNA，使用通用引物27F/1492R 扩增菌株MC042 的16S rRNA 基因序列。将PCR 产物克隆至pMD19-T 载体（TaKaRa）测序。通过BLASTN（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和EzTaxon-e 服务器（http://www.ezbiocloud）对16S rRNA 基因序列进行序列比对[12]。从菌株MC042 基因组序列中提取看家基因gyrB，rpoD 和rpoB 基因序列，采用邻接法和最大似然法构建基于4 种看家基因（16S rRNA，gyrB，rpoD 和rpoB）串联的系统发育树[11]。

1.3 动物回归试验及致病性检测无菌条件下，将菌株MC042 划线接种至TSA 固体培养基，28 ℃培养16 h，用无菌PBS 洗下菌落，3500 r/min 离心20 min 收集菌体，所得菌体用无菌PBS 离心洗涤3 次，按照麦氏比浊法检测菌液浓度后，将菌液配置成1×109cfu/mL（A 组），10 倍倍比稀释得到1×108cfu/mL（B 组）、1×107cfu/mL（C 组）、1×106cfu/mL（D 组）、1×105cfu/mL（E 组）浓度。将健康澳洲墨瑞鳕在实验室暂养10 d 后随机分成6 组，每组30 尾，采用腹鳍基部注射法，分别注射0.5 mL 不同浓度的菌液，对照组注射0.5 mL 灭菌PBS（F 组），每组设置3 个平行组。连续观察7 d，记录死亡情况，计算7 d 总平均死亡率，数据保留小数点后一位。利用IBM SPSS statistics 22.0 软件计算菌株MC042 对健康澳洲墨瑞鳕的半数致死浓度（LD50）。同时取回归感染濒死澳洲墨瑞鳕溃疡组织和内脏组织进行细菌的再分离培养与鉴定，以确定致病菌。

1.4 抗生素敏感试验将菌株MC042接种于TSB培养基中，28 ℃、180 r/min 摇床震荡培养24 h 后，按照麦氏比浊法调整菌悬液浓度为1.0×108cfu/mL，在无菌操作台内均匀涂布于TSA 固体培养基上，待菌液吸收后，用灭菌的镊子将30 种药敏纸片均匀置于培养基上，每个培养皿贴4 片，每种药物设3 个重复。28 ℃培养24 h 后观察，用游标卡尺测量抑菌圈直径，取抑菌环直径平均值，根据美国临床实验室标准研究所出版的药敏试验指南[13]的标准判定菌株对不同药物的敏感性。质控菌株为大肠杆菌（ATCC25922）。

2 结果与讨论

2.1 16S rRNA 基因PCR 扩增结果与序列分析获得的菌株MC042 的16S rRNA 基因序列在GenBank的登录号为LC500601。将该序列提交到EzBio Cloud（https://www.ezbiocloud.net/）进行序列同源性比对分析，发现其属于假单胞菌属（Pseudomonas），16S rRNA 基因序列与Pseudomonas juntendi BML3T相似度最高，为98.9%。看家基因（16S rRNA，gyrB，rpoD 和rpoB 基因序列）串联的系统进化树是假单胞菌分类的重要依据[14]，基于看家基因串联的系统进化树结果显示菌株MC042 隶属于假单胞菌属，与属内的其它菌株具有相对独立的进化地位，与模式菌株Pseudomonas protegens CHA0T和Pseudomonas saponiphila DSM 9751T聚集到一个进化分支（图1），表明其可能与这两个菌株具有相似的生理生化特性。

图1 分离菌基于看家基因（16S rRNA，gyrB，rpoD 和rpoB）串联的系统发育树（邻近法）Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on housekeeping genes(16SrRNA gene sequence,gyrB,rpoD and rpoB)of strain MC042.Bar,0.05 Knuc

2.2 回归感染及致病性试验结果实验组澳洲墨瑞鳕在腹鳍基部接种感染初期，表现为食欲废绝，无力游动，腹部贴于池底；解剖患病或濒死病鱼显示腮部充血、部分内脏有充血病变症状，与自然发病澳洲墨瑞鳕病变相似（图2）。同时，从感染濒死鱼体的溃疡等组织处再次分离到鱼假单胞菌，其形态、生理生化特征与菌株MC042 一致，表明该菌株是澳洲墨瑞鳕患病的病原菌。

利用不同浓度的细菌对健康的澳洲墨瑞鳕进行回归感染后连续观察7 d，发现健康澳洲墨瑞鳕在回归感染2 d 后，A 组全部死亡，总平均死亡率为100%，4 d 以后B 组、C 组、D 组不再出现死亡，总平均死亡率分别为83.3%、66.7%、32.0%，E 组与对照组未见死亡。经计算，菌株MC042 对澳洲墨瑞鳕LD50为4.82×106cfu/mL。

澳洲墨瑞鳕作为新兴产业刚刚起步，关于假单胞菌对其致病性的报道尚较少，本研究通过对本实验室前期分离的鱼假单胞菌MC042 株进一步的研究，首次证实该菌对澳洲墨瑞鳕具有一定的致病性。

图2 自然发病澳洲墨瑞鳕症状Fig.2 Symptoms of Murray cod with natural onset

2.3 分离菌的药敏试验结果质控菌株ATCC25922的抑菌圈大小在允许范围内，药敏结果显示，菌株MC042 对头孢他啶、氧氟沙星、环丙沙星、卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那、哌拉西林、多粘菌素等11种药物敏感；对多西环素和头孢曲松2种药物中度敏感；对四环素、克林霉素、氯霉素、红霉素、头孢拉定、氨苄西林、苯唑西林、呋喃唑酮等17种药物耐药（表1）。由此可见，菌株MC042对β-内酰胺类抗生素中的青霉素类和头孢类多种药物产生耐药性，表现出多重耐药性。假单胞菌能通过产生多种β-内酰胺酶、改变细菌外膜的渗透性和各种主动泵系统以及形成生物膜而对抗生素产生耐药性。

表1 鱼假单胞菌MC042 株药物敏感结果Table 1 Antibiotics susceptibility of Pseudomonas piscis MC042

滥用抗生素的问题在水产养殖中普遍存在，常导致耐药性细菌的出现，同时抗生素残留对人类健康也存在威胁。菌株MC042 的多重耐药性可能与该养殖厂的用药习惯或其自身携带的耐药基因有关。根据本实验药敏试验结果建议生产实践中可优先选择氨基糖苷类和喹诺酮类等抗菌药物治疗由鱼假单胞菌引起的鱼类疾病。因此，在对水产病原菌进行研究时，要着重分析菌株药敏特性，用以指导用药，避免药物的滥用。

本研究通过进一步对鱼假单胞菌MC042 株的基因进化分析，致病性和耐药性研究，为澳洲墨瑞鳕源鱼假单胞菌疾病的防治和澳洲墨瑞鳕高密度循环水健康养殖产业化奠定了基础。