降低脑脊液miR-16的水平对大鼠抑郁样行为的影响*

李桂萍， 宋明芬， 李 静， 王晟东， 刘 义， 刘文娟， 胡霖霖， 张永华

（杭州市第七人民医院 1老年科，2分子生物学实验室，3心身科，浙江杭州310013；4杭州市中医院内科，浙江杭州310007）

目前普遍认为抑郁症的发病是遗传和环境因素相互作用的结果［1-2］。作为表观遗传学中的重要分子，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是真核生物体内一种内源性的、长约20～25 nt、具有调控基因表达功能的非编码 RNA［3］。目前，多个 miRNAs 被报道可能参与了抑郁症发病过程中的基因表达调节［2-4］，例如，miR-16 因其序列与5-羟色胺转运体（serotonin transporter，SERT）的3'端非翻译区匹配，从而可能在翻译水平调节SERT的表达，并介导抗抑郁药的疗效发挥［5-6］；miR-135a 则能同时调节 SERT 和5-HT1a 受体基因表达，与转基因小鼠的焦虑或抑郁样行为改变相关［7］；另外，miR-1202因参与调节代谢型谷氨酸受体4 的表达，被认为与抑郁症的病理机制及其抗抑郁药的疗效相关［8］。

近年来，我们研究发现，抑郁症患者及抑郁大鼠模型脑脊液中 miR-16 水平降低［9-10］，且脑脊液中miR-16 水平的大幅下降可导致大鼠出现抑郁样行为［10］。为进一步明确miR-16 在抑郁症发病机制中的作用，本实验通过人为降低脑脊液中miR-16 至不同水平，着重探讨其与中缝核miR-16 与SERT 水平的剂量反应关系，并观察对抑郁行为学指标的影响，为探明抑郁症发病机制并确定生物标志物提供参考。

材料和方法

1 动物

无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级健康雌性 Sprague-Dawley（SD）大鼠 50 只，购自浙江省医学科学院实验动物中心，动物合格证号为SCXK（浙）2014-0001，8 周龄，体重200～250 g。饲养室温度（25±1）℃，相对湿度（55±5）%，12 h/12 h 明暗交替，充足的水和食物供大鼠自由摄入。

2 方法

2.1 动物分组 将大鼠随机分为空白对照（saline）组、阴性对照（negative control）组及miR-16 拮抗剂5 nmol组、10 nmol组和20 nmol组，每组10只。

2.2 侧脑室注射 大鼠在4%异氟烷（流速1 L/min）诱导麻醉后，固定于脑立体定位仪（购自瑞沃德生命科技有限公司），2%异氟烷（流速0.5 L/min）维持麻醉，定位侧脑室注射点（上切牙板平面比耳间线平面低2.4 mm，保持前囟点后1.2 mm，中线旁开2 mm，深4 mm）。在侧脑室注射点用牙科钻开一小孔，用牙托粉和502 胶混合，固定导管，用于注射溶液。将一次性7 号注射针头剪成长约5 mm 的导管，把插入口磨光滑，并配备略小于导管内径的尼龙线内芯，用于注射后堵塞导管口，防止感染和脑脊液漏，注射体积为20 μL，miR-16拮抗剂（由上海吉玛基因合成）3 个剂量组分别注射miR-16 拮抗剂5、10、20 nmol，阴性对照组和空白对照组大鼠分别注射等量阴性对照液（上海吉玛基因）和生理盐水，隔天注射1次，共3 次。本次实验的miR-16 拮抗剂采用miR-16 antagomir，其经过特殊化学修饰，在动物体内外具有很高的稳定性和抑制miRNA功能发挥的效果。

2.3 蔗糖偏好实验 包括训练和测试2 个部分。在训练实验中，每笼放置2瓶1%的蔗糖溶液，24 h后将其中1 瓶蔗糖溶液换成自来水，24 h 后进行测试。测试阶段，每只大鼠单笼饲养，禁食禁水23 h，给予1瓶为1%的蔗糖溶液和1瓶自来水，1 h后，测定蔗糖水和自来水的消耗量。糖水偏好率（%）=糖水消耗量/（糖水消耗量＋自来水消耗量）×100%。

2.4 强迫游泳实验 采用强迫游泳系统（EthoVision XT）进行实验，游泳桶为高度50 cm、直径30 cm的圆柱形透明塑料桶，水温（25±1）℃，水深30 cm。将大鼠逐一放入水中适应15 min 后，取出烘干，置回笼中。24 h 后，再次将大鼠逐一放入水中，每只大鼠摄像头录像5 min，记录在此期间的不动时间。以大鼠漂浮在水中而不挣扎，仅有必要的动作保持头部在水面以上，或接触水池底部超过1 s 的时间作为不动的标准。

2.5 脑脊液与中缝核的取材 大鼠麻醉后，头颈部剪毛，碘伏消毒，沿纵轴切一约2 cm 的切口，钝性分离颈部背侧肌肉，暴露枕骨大孔，由枕骨大孔进针抽取脑脊液。随后，剪开颅骨，分离脑组织置于冰上，取下脑干，在脑干正中切取约1 mm 厚的组织，即为中缝核。

2.6 RT-qPCR法测定miR-16的表达水平 通过总RNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取脑脊液和中缝核的总RNA，用NanoDrop（Thermo Scientific）测定浓度和纯度；取 2 μg 总 RNA 用 cDNA第1 链合成试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］反转录成cDNA，步骤如下：取10 μL 2×miRNA 转录反应液、2 μL 酶溶液，混合，加入2 μg 总RNA，补足水（无RNAase）至20 μL，37℃放置60 min。通过该反应，在Poly（A）聚合酶的作用下，miRNAs 3’端加上poly A 尾巴；Oligo（dT）与 Poly A 尾巴结合；最后，在逆转录酶的作用下，将总miRNAs 逆转录成cDNA。取cDNA 进行实时定量荧光PCR 扩增测定miR-16 水平，miRNAs 荧光定量检测试剂盒（SYBR Green）购自天根生化科技（北京）有限公司。miR-16的正向引物序列为5'-TAGCAGCACGTAAATTGGCG-3'，反向引物从miRNAs荧光定量检测试剂盒中获得，序列未显示。反应体系为20 μL，包含10 μL 2×反应缓冲液、0.5 μL 正向引物（终浓度0.25 μmol/L）、0.5 μL 反向引物（终浓度 0.25 μmol/L）、1 μL cDNA 模板、1 μL ROX 染料、7 μL 水（无 RNAase）。PCR 扩增程序为94℃ 2 min 预变性；然后94℃ 20 s、52℃ 30 s、72℃ 30 s，循环 35 次。荧光 PCR 仪购自 ABI（型号 StepOne Plus），获得 Ct值，并根据内参照 U6 计算 miR-16 的相对含量。

2.7 Western blot法测定SERT蛋白的表达 使用总蛋白提取试剂盒（碧云天生物技术有限公司）提取中缝核组织的总蛋白，并且通过BCA 法对蛋白进行定量。取8 μL蛋白提取液（约50 μg）与2 μL 5×上样缓冲液混合后，置于沸水中5 min，使蛋白变性，冷却至室温后，上样至SDS-PAGE 胶的加样孔中，100 V 电泳2 h（电泳装置为Bio-Rad 生产）。电泳结束后，用转膜装置在300 mA 电流下将蛋白转至PVDF 膜上。PVDF 膜经封闭后，进行I抗和II抗孵育，然后进行化学发光、显影和定影。抗SERTI抗和II 抗均购自Santa Cruz。使用ChemiDocTMXRS+分子成像仪（Bio-Rad）进行蛋白条带分析，并用内参照β-actin 校正，得出SERT蛋白的相对水平。

3 统计学处理

统计分析采用SPSS 19.0 统计学软件。实验数据用均数±标准差（mean±SD）表示，5 组间脑脊液miR-16 和中缝核miR-16、中缝核SERT 水平及抑郁样行为指标的比较采用方差分析，组间比较采用SNK-q检验，组内治疗前后比较采用配对t检验，3 个剂量拮抗剂组间的剂量反应关系分析采用Spearman偏相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 脑脊液中miR-16水平的变化

空白对照组与阴性对照组比较，脑脊液中miR-16 水平的差异无统计学显著性（P＞0.05）；拮抗剂5 nmol 组、10 nmol 组和 20 nmol 组 miR-16 水平均显著低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05），见图1。脑脊液中miR-16 水平与拮抗剂的注射剂量呈负相关关系（r=-0.92，P＜0.05）。

Figure 1.Relative miR-16 level in cerebrospinal fluid（CSF）of the rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs saline group；##P＜0.01 vs negative control group.图1 各组大鼠脑脊液miR-16水平的比较

2 中缝核miR-16水平的变化

空白对照组与阴性对照组比较，中缝核中miR-16 水平的差异无统计学显著性（P＞0.05）；拮抗剂5 nmol 组、10 nmol 组和 20 nmol 组中缝核 miR-16 水平均显著低于空白对照和阴性对照组（P＜0.05），见图2。中缝核miR-16 水平与拮抗剂的注射剂量呈负相关关系（r=-0.57，P＜0.05）。

Figure 2.Relative miR-16 levels in raphe nuclei of the rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs saline group；##P＜0.01 vs negative control group.图2 各组大鼠中缝核miR-16水平的比较

3 中缝核SERT的蛋白水平变化

与阴性对照组比较，空白对照组中缝核中SERT蛋白水平的差异无统计学显著性（P＞0.05）；拮抗剂5 nmol 组、10 nmol 组和 20 nmol 组中缝核 SERT 蛋白水平均显著高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05或P＜0.01），见图3。中缝核SERT 蛋白水平与拮抗剂的注射剂量呈正相关关系（r=0.49，P＜0.05）。

Figure 3.Western blot was used to determine the protein levels of SERT in the raphe nuclei of rats with different treatments.Mean±SD. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs saline group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs negative control group.图3 Western blot检测各组中缝核SERT的蛋白水平

4 行为学指标的变化

采用蔗糖偏好实验和强迫游泳实验评价大鼠的抑郁样行为。注射前，蔗糖偏好率和不动时间在各组间比较差异无统计学显著性（P＞0.05）。注射后，两指标的组间差异显著（P＜0.05），其中10 nmol组和20 nmol 组的蔗糖偏好率明显低于空白对照组、阴性对照组及同组注射前（P＜0.05，P＜0.01），不动时间明显长于空白对照组、阴性对照组及同组注射前（P＜0.01）。3个剂量组之间比较，随着注射剂量的增加，蔗糖偏好率显著降低、不动时间则明显延长（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

讨 论

研究证实，许多miRNAs在神经系统中的特异表达，与神经系统发育、分化、生长、记忆、突触可塑性及生物钟调节等密切相关［11-12］，其中，miR-16 被认为与抑郁症的关系十分密切。2010 年，Baudry 等［6］在《Science》上发表论文称，1C11 神经内分泌细胞系有两个分化方向，即分泌去甲肾上腺素的细胞系和分泌5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的细胞系，其中分泌去甲肾上腺素的细胞系miR-16 表达水平低，但是SERT 合成增加；而分泌5-HT 的细胞系则相反，由此作者首次提出miR-16 与SERT 的靶标关系；另外，该研究还指出选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs）氟西汀通过miR-16 介导了SERT 蛋白的抑制性表达。而后，又有研究者以人肺癌上皮细胞A549、人胎盘绒膜癌细胞系JAR及大鼠中缝核神经元细胞系RN46A为研究对象来研究miR-16 与SERT 的靶标关系，结果表明，miR-16 通过下调SERT基因的表达而影响5-HT递质转运系统［13-14］。

基于miR-16 对SERT基因表达的调节作用，miR-16 可能参与抑郁症的病理生理过程。但是，抑郁症患者血液中miR-16 的水平与健康对照比较无统计学差异［10］，分析原因，可能是由于血液中的miR-16 受体内外多种因素的影响，其在抑郁症患者和健康对照间的差异已不甚明显，从而限制了其在抑郁症发病中的作用。

众所周知，脑脊液因其所在的部位及其生理学作用，比血液能更好地反应大脑病理过程中的各项指标变化［15-16］。在脊椎动物体内，脑组织内有丰富的miRNAs［17］，一方面提示 miRNAs 可能在脑功能的发挥中起着重要作用，另一方面，脑脊液miRNAs 的表达水平可能有别于血液miRNAs，它或许能反映脑组织中的某些变化。已有研究者指出，脑脊液中的miRNAs 可能参与某些神精疾病的病理过程，如阿尔茨海默病患者［18］和帕金森氏病患者［19］的脑脊液中，均有miRNAs 的表达异常，miRNAs 可能成为这些疾病的生物标志［20］。在抑郁症方面，Wan 等［21］对抑郁症患者脑脊液中miRNAs 进行了检测，发现血清中miR-221-3p，miR-34a-5p和let-7d-3p 水平高于健康对照，而miR-451a 水平低于健康对照。我们研究发现，抑郁症患者的脑脊液miR-16 水平明显低于健康对照组［10］，另外，我们建立慢性不可预知温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型，检测了该模型大鼠脑脊液中miR-16 的水平，也得出其水平低于对照组大鼠的结果［9］。

表1 各组大鼠蔗糖偏好率与不动时间的比较Table 1.Sucrose preference rates and immobility time among each group（Mean±SD. n=10）

miRNA 拮抗剂成为近年来研究miRNA 沉默作用的重要手段，它是根据miRNA 成熟体序列而设计的单链RNA，通过与体内成熟miRNA 结合，阻止miRNA 与其靶基因mRNA 的互补配对的同时，引起miRNA 降解，从而抑制miRNA 发挥作用。为进一步验证miR-16 在抑郁症发病机制中的作用，本实验通过侧脑室注射miRNA 拮抗剂，探讨人为降低脑脊液miR-16 至不同水平对中缝核miR-16 和SERT 水平的影响及其剂量反应关系。结果显示，各拮抗剂组的脑脊液miR-16 水平和中缝核miR-16 水平与对照组比较，均有不同程度的下降，而中缝核SERT 蛋白水平则增加，该结果与其他文献报道一致，即miRNA拮抗剂能有效降低动物体内miRNA 水平、提升其靶基因表达［6，22］。但是，目前的研究均未进行剂量反应关系探讨，而本实验得出miR-16 拮抗剂注射剂量与中缝核miR-16 水平呈负相关关系、与中缝核SERT蛋白表达呈正相关关系，这是本实验的特色之一。

在抑郁行为学实验中，拮抗剂10 nmol 组和20 nmol 组表现出明显的抑郁样行为，而5 nmol 组的抑郁样行为尚不明显，可能是因为miR-16 的小幅下降尚不能达到引起行为改变的阈值，对此有待进一步研究。

本次实验中，虽然各剂量组脑脊液miR-16 水平下降明显，但是中缝核miR-16 和SERT 水平却变化有限（约10%～20%），其原因可能有以下几点：（1）注入的miR-16 拮抗剂随脑脊液流动而分布于其他脑区，减少了进入中缝核的量；（2）中缝核miR-16 水平下降后，机体启动负反馈性调节，从而使中缝核miR-16 下降不明显；（3）除了 miR-16 外，SERT基因表达还受其他因素调节，比如miR135a［7］。目前的研究显示，miRNAs 与靶基因并非一一对应关系，即每个miRNA 可以有多个靶基因，而几个miRNAs 也可以共同调节同一个基因［23］。根据文献报道，抑郁症患者血液和脑组织中的miR135a 水平显著降低；服用抗抑郁药后，miR135a 水平上调；miR-135a基因过表达小鼠的中缝核SERT 蛋白表达明显降低，而miR-135a基因敲除小鼠则相反［7］。因此，基于基因表达调节的多因素性，miR-16 水平降低可能在一定程度上影响到SERT基因表达。

本研究存在的不足：（1）只分析了降低脑脊液miR-16 水平对中缝核组织的影响。海马、前额叶和蓝斑核等都可能参与抑郁症的发生和发展［6，11，24］；（2）只分析了对SERT基因的调节作用。根据miRNAs 对基因调节的网络作用，miR-16 可能还参与其他抑郁症相关基因的调节［23］；（3）未将 miR-16 与其他 miRNAs（如 miR-135a）结合来探讨对SERT基因表达以及抑郁样行为的影响。后续实验有待针对以上不足，进行深入研究。

总之，本次实验表明，降低脑脊液miR-16 水平可影响大鼠中缝核miR-16 及SERT基因表达，并与抑郁样行为相关，初步探明脑脊液miR-16 作为抑郁症生物标志物和新治疗靶点的可行性。