27nt-miRNA对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响*

赵燕姣， 颜渊鸳， 李 丹， 罗雪兰， 杨 鹏，周福隆， 杨瑞霞， 唐双意， 欧和生△

（1广西医科大学药学院，广西南宁530021；2广西中医药大学附属国际壮医医院科技部，广西南宁530201；3广西医科大学第一附属医院药学部，广西南宁530021）

血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VECs）是一层位于血管壁内侧的扁平单层细胞。正常生理情况下，VECs 通过调节血流与血管壁之间的物质交换维持着血管内环境稳态；在血管损伤，机械损伤，及氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL）、活性氧、促炎细胞因子和高水平的一氧化氮（nitric oxide，NO）等生物活性因子的刺激作用下，VECs 的通透性发生改变，导致炎症细胞入侵和血管壁脂质沉积，从而导致血管壁增厚与管腔狭窄。Ox-LDL 是一种动脉粥样硬化的促进因子，它可与内皮细胞表面的LOX-1 受体结合以诱发氧化连接反应导致胆固醇沉积，从而引起细胞凋亡［1］。VECs凋亡在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）等血管生成性疾病的发病机制中发挥着重要作用［2］。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一类含有19～22 个核苷酸（nucleotide，nt）的高度保守的非编码单链小分子 RNA［3］。新近研究显示，miRNA 逐渐成为血管生成性疾病相关内皮细胞调亡的重要调控因子，如miR126-3p 高表达可以抑制HLMVEC 的增殖、促进其凋亡，使血管生成所阻［4］；miR-106b 可通过调节PTEN 的表达激活PI3K/AKT 通路，促进HAEC 增殖，抑制其凋亡［5］。我们的前期研究证实，来自内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）第4 内含子中的27 碱基重复序列转录的RNA（27nt-miRNA，27nt-miR）高表达可显著抑制人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的增殖、迁移和血管生成，这与27nt-miR 抑制eNOS 的表达/活性及其代谢产物NO的合成与释放相关［6］。由于NO 不仅是维持血管舒张功能的重要因子，而且参与内皮细胞的增殖、迁移和凋亡的调节［7］，故推测 27nt-miR 可通过对相关凋亡基因的调控，参与VECs增殖、迁移与凋亡的调节。为证实上述推测，本研究通过建立体外Ox-LDL 诱导HUVECs 凋亡模型 ，探 讨 27nt-miR 对 Ox-LDL 诱 导HUVECs 凋亡的影响以及作用机制，为AS 等慢性心血管疾病的治疗提供参考资料。

材料和方法

1 主要试剂和仪器

HUVECs（Procell）；DMEM培养液（Gibco）；胎牛血清（Lonsera）；慢病毒载体（上海吉凯基因化学技术有限公司）；氧化低密度脂蛋白（广州奕元生物技术公司）；CCK-8（武汉博士德生物技术公司）；Hoechst 33258 染色试剂盒和caspase-3 活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Annexin V-APC/7-AAD 凋亡检测试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）；TRIzol 试剂盒（Axygen）；逆转录试剂盒和SYBR RT-qPCR 试剂盒（TaKaRa）；兔抗 Bcl-2 抗体、兔抗 Bax 抗体、兔抗 caspase-3 抗体、兔抗 GAPDH 抗体及抗兔lgG（H+L）荧光II 抗（Cell Signaling Technology）。实时荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems）；倒置相差荧光显微镜（Olympus）。

2 方法

2.1 27 nt-miR 慢病毒载体的构建和鉴定 委托上海吉凯基因化学技术有限公司以27nt-miR 序列（5′-GUCAUCAGUCGAGCUAGACGAG-3′）设计27nt-miR高表达慢病毒载体，然后以其反义序列及阴性对照随机序列构建anti-27nt-miR 和miR-NC 慢病毒载体。以 Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-Puromycin 为载体，经AgeI/NheI 双酶切，转染293T 细胞，浓缩得到目的慢病毒载体。病毒载体上含有绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白，可观察绿色荧光表达并用嘌呤霉素筛选得到稳定细胞株。

2.2 HUVECs 慢病毒质粒转染和实验分组 取对数生长期细胞，以细胞密度为5×107/L，按每孔2 mL将细胞悬液接种于6 孔板，孵育过夜至细胞贴壁。上述3 种慢病毒载体以感染指数（multiplicity of infection，MOI）=70 感染HUVECs，置于培养箱中转染10 h 后更换新鲜完全培养液。参考 Zhang 等［5］的方法，实验分为5 组：（1）正常对照组；（2）Ox-LDL 组；（3） 27nt-miR+Ox-LDL 组 ；（4） anti-27nt-miR+Ox-LDL 组；（5）miR-NC+Ox-LDL 组。除正常对照组正常培养外，Ox-LDL 组给予40 mg/L Ox-LDL 处理48 h诱导细胞凋亡，其余转染组细胞均先转染相应慢病毒质粒继而给予40 mg/L Ox-LDL 处理48 h 诱导细胞凋亡。

2.3 CCK-8 法检测 HUVECs 活力 参考蔡爽等［8］的方法，将各组细胞接种到96孔板中，每孔5×103个，每组设置3 个复孔，待细胞贴壁后按设定实验条件处理，每孔加入110 μL CCK-8 试剂（100 μL 培养液+10 μL CCK-8），避光孵育 1 h 后，酶标仪检测 450 nm 波长处各组的吸光度（A450），实验重复3 次。细胞活力（%）=（实验组A450值-调零组A450值）/（空白组A450值-调零组A450值）×100%。

2.4 划痕法检测HUVECs 的迁移能力 参考沈凤等［9］的方法，将各组细胞接种于 48 孔板中，每孔 3×104个，每组设置3 个复孔，培养细胞至密度100%融合，用吸头垂直各孔底部中间划“一”字痕，PBS 冲洗3次，然后加入含40 mg/L Ox-LDL的无血清培养液继续培养，于显微镜下观察0 h 和24 h 的迁移愈合情况，实验重复3 次。迁移率（%）=（0 h 划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

2.5 caspase-3 活性试剂盒检测caspase-3 活性 参考Chen等［10］的方法，取各组细胞接种于6孔板中，每孔2×105个，每组设置3个复孔，培养箱中培养至细胞贴壁后，加入含40 mg/L Ox-LDL 的无血清培养液2 mL 继续培养48 h。收集并冰浴裂解各组细胞，取上清液 50 μL，加入 40 μL 检测液和 10 μL Ac-DEVD-pNA，避光孵育2 h，酶标仪检测405 nm 波长处各组的吸光度（A405），实验重复3次。

2.6 Hoechst 33258 染色法检测HUVECs 的凋亡情况 参考李松岩等［11］的方法，取无菌盖玻片置于6孔板内，将各组细胞以每孔5×104个接种于玻片上，待细胞生长至密度为70%时，每组分别加入40 mg/L的Ox-LDL 刺激48 h，弃去培养液，加入0.5 mL 固定液 10 min。PBS 洗涤 3 次，加入染色液 5 min，PBS 洗涤3 次。将荧光淬灭封片液滴于载玻片上，盖上盖玻片。荧光显微镜下随机拍取5 个不同的视野，计算细胞凋亡率，实验重复3 次。细胞凋亡率（%）=视野内细胞凋亡数/视野内总细胞数×100%

2.7 流式细胞术检测各组HUVECs 的凋亡率 参考蔡爽等［8］的方法，取各组细胞接种于6 孔板中，每孔 2×105个，待细胞贴壁后给予 40 mg/L 的 Ox-LDL 处理48 h。收集细胞并清洗。取500 μL上样缓冲液重悬细胞。每管依次加入5 μL Annexin V-APC 和5 μL 7-AAD，轻柔混匀后，室温避光孵育15 min，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次。

2.8 RT-qPCR 法检测 HUVECs 中 Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA表达情况 用Trizol试剂盒提取各组细胞总RNA。委托上海生工生物工程设计、合成目标引物，序列见表1。分别取各组细胞总RNA 1 μg，根据逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA，以cDNA 为模板，按SYBR RT-qPCR 试剂盒说明书加入反应体系，上机检测。每个样本重复测定3 次，取平均值，以 GAPDH 为内参照，采用 2-ΔΔCt法进行数据分析。反应条件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，40 个循环；最后 72℃延伸 5 min，终止反应。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.9 Western blot 法 检测 HUVECs 中 Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表达情况 收集并裂解各组细胞，取上清液，BCA 法检测蛋白浓度。分别取40 μg蛋白进行SDS-PAGE、转膜，分别加入相应Ⅰ抗稀释液（稀释比例1∶1 000），4℃孵育过夜。次日加入荧光Ⅱ抗（稀释比例1∶10 000）室温避光孵育1 h。利用LICOR 公司的Odyssey 红外荧光扫描成像系统分析蛋白电泳条带灰度值，以GAPDH 为内参照。蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。实验重复3次。

3 统计学处理

采用SPSS 25.0统计软件分析实验数据，数据均以均数±标准差（mean±SD）表示。单因素方差分析用于多组间比较，LSD-t检验用于组间两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 27nt-miR 对 Ox-LDL 诱导的 HUVECs 活力的影响

与正常对照组相比，Ox-LDL 组细胞活力显著降低（P＜0.05）；与miR-NC+Ox-LDL 组相比，27nt-miR+Ox-LDL 组细胞活力显著降低（P＜0.05），而anti-27ntmiR+Ox-LDL组细胞活力显著升高（P＜0.05），见图1。

Figure 1.27nt-miR inhibited the viability of HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.图1 27nt-miR抑制HUVECs活力

2 27nt-miR 对 Ox-LDL 诱导的 HUVECs 迁移能力的影响

与正常对照组相比，Ox-LDL 组HUVECs 迁移率降低（P＜0.05）；与 miR-NC+Ox-LDL 组相比，27ntmiR+Ox-LDL 组HUVECs 迁移率显著降低（P＜0.05），而anti-27nt-miR+Ox-LDL 组HUVECs 迁移率显著升高（P＜0.05），见图2。

3 27nt-miR 对 Ox-LDL 诱 导 的 HUVECs 中 cas⁃pase-3活性的影响

与正常对照组相比，Ox-LDL 组HUVECs 内caspase-3 相对活性升高（P＜0.05）；与miR-NC+Ox-LDL组相比，27nt-miR+Ox-LDL 组 HUVECs 内 caspase-3的相对活性显著升高（P＜0.05），而anti-27nt-miR+Ox-LDL 组 HUVECs 内 caspase-3 的相对活性显著降低（P＜0.05），见图3。

4 27nt-miR对Ox-LDL诱导HUVECs凋亡的影响

Ox-LDL 组HUVECs 的凋亡率显著高于正常对照组（P＜0.05）；与 miR-NC+Ox-LDL 组相比，27ntmiR+Ox-LDL 组HUVECs 的凋亡率升高（P＜0.05），而anti-27nt-miR+Ox-LDL 组HUVECs 的凋亡率降低（P＜0.05），见图4。

5 27nt-miR 对 Ox-LDL 诱导的 HUVECs 凋亡率的影响

与正常对照组相比，Ox-LDL 组HUVECs 的凋亡率显著升高（P＜0.05）；与miR-NC+Ox-LDL 组相比，27nt-miR+Ox-LDL 组HUVECs 的凋亡率显著升高（P＜0.05），而anti-27nt-miR+Ox-LDL组HUVECs的凋亡率显著降低（P＜0.05），见图5。

6 27nt-miR 对 Bax、caspase-3和Bcl-2 mRNA 表达的影响

与正常对照组相比，Ox-LDL 组Bax 和caspase-3 mRNA 的相对表达量显著升高（P＜0.05），而 Bcl-2 mRNA 的相对表达量和Bcl-2/Bax 的mRNA 表达比例显著降低（P＜0.05）；与 miR-NC+Ox-LDL 组相比，27nt-miR+Ox-LDL 组 Bax和caspase-3 mRNA 的 相 对表达量显著升高（P＜0.05），Bcl-2 mRNA的相对表达量和Bcl-2/Bax 的mRNA 表达比例显著降低（P＜0.05），而 anti-27nt-miR+Ox-LDL 组 Bax和caspase-3的 mRNA 相对表达量显著降低（P＜0.05），Bcl-2 mRNA 的相对表达量和Bcl-2/Bax 的mRNA 表达比例显著升高（P＜0.05），见图6。

7 27nt-miR 对 Bax、caspase-3和Bcl-2 蛋白表达的影响

Ox-LDL组Bax和caspase-3蛋白表达水平高于正常对照组（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白表达水平和Bcl-2/Bax 蛋白表达比例低于正常对照组（P＜0.05）；27ntmiR+Ox-LDL 组 Bax和caspase-3 蛋白表达水平较miR-NC+Ox-LDL 组上调（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达水平和 Bcl-2/Bax 蛋白表达比例下调（P＜0.05）；而anti-27nt-miR+Ox-LDL 组 Bax和caspase-3 蛋 白 表 达水平较 miR-NC+Ox-LDL 组下调（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达水平和Bcl-2/Bax 蛋白表达比例上调（P＜0.05），见图7。

Figure 2.27nt-miR inhibited the migration of HUVECs.The scale bar=20 μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.图2 27nt-miR抑制HUVECs的迁移

Figure 3.27nt-miR increased the activity of caspase-3 in the HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group图3 27nt-miR增强HUVECs内caspase-3活性

讨 论

本实验通过研究27nt-miR 对Ox-LDL 诱导的HUVECs 凋亡的影响及相关分子机制，得到结果如下：（1）27nt-miR 可促进Ox-LDL 诱导的内皮细胞凋亡；（2）27nt-miR 促进Ox-LDL 诱导的内皮细胞凋亡的同时，抑制细胞的活力和迁移；（3）27nt-miR 通过促进Ox-LDL诱导的Bax和caspase-3表达上调及Bcl-2表达下调参与细胞凋亡进程。

内皮细胞凋亡可破坏内皮完整性和屏障功能，引起炎性细胞浸润，脂质转运和新内膜形成，促进脂质沉积，导致AS等血管疾病的发生发展［12］。Ox-LDL是引发和促进AS 等心血管疾病发生发展的危险因素之一，它可诱导内皮细胞凋亡。研究表明，正常生理条件下，低浓度的Ox-LDL 促进内皮细胞增殖，在维持血管壁环境稳态中起重要作用，而高浓度的Ox-LDL 则可引发内皮细胞凋亡或坏死［1］。研究表明，Ox-LDL 可通过调控PI3K/Akt 信号通路诱导内皮祖细胞凋亡，引起组织缺血和血管形成受损，加重冠状动脉进程［13］。本实验中，观察到使用 Ox-LDL 刺激HUVECs 后细胞的凋亡率显著上升，细胞活力和迁移率显著下降，提示Ox-LDL 对HUVECs 具有明显的凋亡诱导作用。

内皮细胞的异常凋亡、增殖和迁移是AS 等心血管疾病发展中的重要致病事件［14］。miRNA 作为基因转录调控分子，通过调节内皮细胞的增殖、迁移和凋亡参与心血管疾病的发生发展［15］。例如，miR-200c-3p 通过结合锌指结合E-box 的同源盒2，抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾动脉内皮细胞增殖和迁移，减轻高血压性肾损伤［16］。miR-345-3p 在 Ox-LDL 诱导的HUVECs 凋亡过程中表达下调，其通过靶向TRAF6抑制Ox-LDL 诱导的细胞凋亡和炎症反应，减缓 AS 的发展［17］。miR-497 在 AS 模型鼠和 Ox-LDL 诱导HUVECs凋亡过程中均表达上调，其通过调控Bcl-2/Bax-caspase-9-caspase-3 途径抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，加重AS 炎症程度［18］。本课题组前期研究表明，27nt-miR 参与调节VECs 的增殖、迁移和管腔形成，并抑制哺乳动物雷帕酶素靶蛋白诱导的VSMCs 凋亡［19］。在本实验中，我们通过将 27nt-miR高表达与anti-27nt-miR 慢病毒质粒转染入HUVECs，之后用Ox-LDL刺激HUVECs，结果显示，27nt-miR 高表达可显著提高内皮细胞的凋亡率，与此同时内皮细胞的增殖速度与迁移能力显著降低，而抑制27ntmiR 表达则可以部分缓解Ox-LDL 诱导的细胞凋亡和增殖、迁移抑制。这一结果提示27nt-miR 可促进Ox-LDL 诱导的 HUVECs 凋亡，并且抑制 HUVECs 增殖和迁移。

Figure 4.27nt-miR promoted the apoptosis of HUVECs induced by Ox-LDL.The apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining.The scale bar=20 μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.图4 27nt-miR促进Ox-LDL诱导的HUVECs凋亡

Bcl-2 是一种抗凋亡蛋白，可以通过抑制线粒体细胞色素C的释放，激活下联caspase级联反应，或作为抗氧化剂防止多种刺激诱导的细胞凋亡［20］。Bax是Bcl-2 同源的水溶性相关蛋白，凋亡发生时，Bax从细胞质转移至线粒体，Bax 蛋白被激活，诱导线粒体膜电位降低，促使线粒体释放细胞色素C，激活半胱氨酸蛋白酶caspase-9，继而活化下游效应蛋白caspase-3，从而诱导细胞凋亡［21］。caspase-3作为半胱氨酸蛋白酶家族一员，是细胞凋亡蛋白级联反应中的下游关键蛋白，被认为是凋亡中的关键调节因子。因此，caspase-3 活性是凋亡过程主要的指标。本研究结果显示，27nt-miR 高表达可负调控Bcl-2 蛋白表达水平，促进Bax 和caspase-3 的蛋白表达，增强caspase-3 活性，而抑制27nt-miR 表达则表现出相反的趋势。因此，我们推测27nt-miR 可能通过调控凋亡相关蛋白 caspase-3、Bax和Bcl-2 的表达，影响 Ox-LDL 诱导内皮细胞凋亡的进程。此外，值得注意的是，多数miRNAs在基因转录水平通过抑制翻译或促进RNA 降解调控靶基因表达，例如miR-338-3p 通过靶向抑制AMBI的mRNA 3'非翻译区抑制其表达，促进Ox-LDL 诱导的内皮细胞凋亡［22］。因此，本研究进一步通过 qRT-PCR 检测各组 Bax、caspase-3和Bcl-2的mRNA 改变情况，结果显示，27nt-miR 高表达显著促 进 Bax和caspase-3 的 mRNA 表 达 ，而 Bcl-2 的mRNA 表达和Bcl-2/Bax 比例均显著降低。这提示27nt-miR 在基因转录水平参与了 Bax、caspase-3 和Bcl-2 mRNA 的调控，进而影响了 Bax、caspase-3 和Bcl-2 的蛋白表达，最终参与Ox-LDL 诱导内皮细胞凋亡的进程。

Figure 5.27nt-miR promoted the apoptosis of HUVECs induced by Ox-LDL.The apoptosis was detected by flow cytometry.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.图5 27nt-miR促进Ox-LDL诱导的HUVECs凋亡

综上所述，本研究初步明确27nt-miR 可促进Ox-LDL诱导的HUVECs凋亡，并抑制HUVECs的活力和迁移，这与27nt-miR 调控凋亡相关蛋白Bax、caspase-3和Bcl-2表达有关。

Figure 6.27nt-miR up-regulated the mRNA expression levels of Bax and caspase-3 and down-regulated the mRNA expression level of Bcl-2 in the HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.图6 27nt-miR上调HUVECs中Bax和caspase-3 mRNA表达水平，下调Bcl-2 mRNA表达水平

Figure 7.27nt-miR up-regulated the protein expression levels of Bax and caspase-3 and down-regulated the protein expression level of Bcl-2 in the HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.图7 27nt-miR上调HUVECs中Bax和caspase-3蛋白表达水平，下调Bcl-2蛋白表达水平