杞菊地黄丸配合针刺阳陵泉对帕金森大鼠神经保护机制研究

邵 跃 斌

(广州市红十字会医院医务科 广州 510220)

帕金森病 (Parkinson's disease，PD)是一种是常见于中老年人的进行性中枢神经系统退行性疾病[1]，其临床表现与中医学中“颤证”、“痉病”等病证的描述相似。杞菊地黄丸是治疗肝肾阴亏的经典方剂，阳陵泉是治疗筋病的要穴，两者联合应用治疗帕金森病收到了良好的疗效，但其神经保护机制尚未明确。本课题通过复制帕金森大鼠模型，探讨杞菊地黄丸配合针刺阳陵泉对帕金森病的防治作用及可能的神经保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药物

6～8周龄SPF级SD大鼠，体重(200±20)g，由广东省实验动物中心提供。

杞菊地黄丸配方：枸杞子、菊花、熟地黄、 酒萸肉、 牡丹皮、山药、茯苓、泽泻。 6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)： 美国Sigma 公司产品； 阿朴吗啡(apomorphine，APO)：美国Sigma 公司产品。

1.2 帕金森动物模型制作

10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后固定于立体定位仪上，头部备皮消毒，沿正中矢状线切开颅顶皮肤，剥离骨膜，暴露前囟。确定右侧黑质二坐标：(1)前囟后5.2mm，正中线右侧1.0mm，硬膜下9.0mm；(2)前囟后5.2mm，正中线右侧2.5mm，硬膜下8.5mm。用微量注射器以1μl/min速度分别向每点注射6-OHDA(溶于含0.2%维生素C的生理盐水中，浓度为2μg/μl)3μl，注射完毕后留针5min, 而后以1.0mm/min速度缓慢退针；缝合头皮，腹腔注射庆大霉素，待大鼠清醒后放回笼内饲养；10d后，腹腔注射APO 0.5mg/kg 诱发大鼠向一侧旋转，记录开始旋转至30min内的旋转圈数，以每分钟旋转圈数平均超过7次者为合格的帕金森模型。

1.3 实验动物分组及给药

将造模成功的30只PD大鼠随机分为模型组、左旋多巴阳性对照组和中医综合治疗组，每组10只，另纳入10只正常SD大鼠作为正常对照组。左旋多巴阳性对照组给予腹腔注射左旋多巴40mg/kg, 中医综合治疗组给予每天灌胃2g生药/kg并针刺阳陵泉穴，连续给药4周。模型组和正常组用等量生理盐水灌胃。

1.4 SOD活性及GSH含量的检测

实验动物处死后，分离左侧纹状体及黑质组织，加入生理盐水冰浴匀浆，收集匀浆液4℃ 5000r/min 离心15min后，取上清液。取适量上清液进行SOD活性、GSH含量的检测，具体方法按碧云天公司试剂盒说明书步骤进行测试。

1.5 Western Blot检测BDNF表达

左侧纹状体及黑质组织盐水冰浴匀浆后，用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白(碧云天，中国)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，中国)测定蛋白浓度。经12% SDS/PAGE 电泳分离后转膜，用TBST配制的含5%脱脂奶粉的封闭液封闭2h后加一抗4℃孵育过夜：GAPDH抗体(Abcam，美国)、 BDNF抗体(Abcam，美国)。次日洗膜，室温孵育相应HRP标记的二抗1h，ECL化学发光法检测相关蛋白表达。以目的蛋白与内参GAPDH的比值作为蛋白相对表达量。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 杞菊地黄丸配合针刺阳陵泉对PD大鼠GSH、SOD的影响

模型组与正常对照组比较，GSH、SOD 明显降低，左旋多巴阳性对照组GSH、SOD水平均较模型组有明显升高，而中医综合治疗组中GSH、SOD水平均较模型组也有所升高，差异均有显著意义(P<0.05)，见图1。

图1 GSH(A)、SOD(B)水平检测(*P<0.05)

2.2 杞菊地黄丸配合针刺阳陵泉对PD大鼠BDNF表达的影响

模型组与正常对照组比较，BDNF表达明显降低，左旋多巴阳性对照组与模型组比较，BDNF表达明显升高，而中医综合治疗组中BDNF表达与模型组比较也有所升高，差异均有显著意义(P<0.05)，见图2。

图2 BDNF蛋白表达检测(*P<0.05)

3 讨论

帕金森病的病理基础是中脑黑质多巴胺能神经元慢性进行性退变、坏死。许多学者认为氧化应激是黑质DA能神经元选择性损伤的关键因素[2～3]。GSH 系统是脑组织内最重要的抗氧化系统[4], PD患者黑质中GSH减少，加剧了自由基损害[5]；SOD能清除O2-，其活力的高低间接反应了机体清除自由基的能力。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)在中枢神经系统发育过程中对神经元的生存分化、生长起重要作用，且已经被证明在体内外均可促进中脑多巴胺神经元的生存和分化[6]。

本研究发现，PD模型组GSH、SOD表达明显低于正常对照组，BDNF表达量也明显降低，在左旋多巴阳性对照组中各指标均有回升，与文献报道一致。本研究结果显示，杞菊地黄丸配合针刺阳陵泉治疗后，PD大鼠的GSH、SOD表达量明显高于模型组，BDNF表达也有所升高，差异有显著意义(P<0.05)，表明杞菊地黄丸配合针刺阳陵泉治疗能够改善PD大鼠纹状体匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)以及黑质脑源性神经营养因子(BDNF)表达，提示其抗氧化作用及神经保护作用。

帕金森病的临床表现与中医学中“颤证“、“痉病”等病证的描述相似，对于其发病机制现在还存在一定争议，而肝肾亏虚是各学者都一致认同的发病基础[7]。而且，在临床的辨证分型中，阴虚内动型也是最为常见的证型[8]。

杞菊地黄丸源于滋阴的代表方六味地黄丸，同时添加菊花、枸杞所成。方中主药熟地能甘柔补血，滋肾填精，泽泻可宣泄肾浊，丹皮清泻肝火，山萸肉涩精固脱，茯苓渗脾利湿，山药收敛脾经，菊花清肝明目，枸杞养肝滋肾，诸药共同作用，实现滋肾养肝之功效，能够改善肝肾阴亏的诸多症状。阳陵泉是治疗筋病的要穴，临床较为常用，具有舒筋和壮筋的作用。近年来通过针刺阳陵泉治疗痉挛性偏瘫、运动功能障碍、神经麻痹等疾病的报道屡见不鲜[9～10]，也是针刺治疗帕金森病的最常用穴位之一[11]。我们在临床中采用杞菊地黄丸配合针刺阳陵泉治疗帕金森病，收到了改善临床症状、提高患者生活质量、延缓疾病发展的效果，且此方法操作简单易行，患者依从性强，有利于临床推广。

本研究借助PD大鼠模型，给予杞菊地黄丸灌胃和针刺阳陵泉，并检测PD大鼠的纹状体匀浆上清液中SOD活性、GSH含量，及黑质组织BDNF表达变化，证明杞菊地黄丸配合针刺阳陵泉对帕金森大鼠有抗氧化防治作用及神经保护作用，为临床推广应用提供了依据。