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反式白藜芦醇对血管性痴呆模型大鼠海马神经元的保护作用

2020-11-02吴竞婧徐平

中国老年学杂志 2020年20期
关键词:反式白藜芦醇血管性

吴竞婧 徐平

(遵义医科大学 1第三附属医院 遵义市第一人民医院,贵州 遵义 563000;2附属医院神经内科)

血管性痴呆发病率高、病因复杂,主要因缺血性脑卒中及全脑性缺氧缺血导致发病,多数患者伴明显的偏瘫、感觉不适等症状,严重影响患者的日常生活〔1〕。目前,血管性痴呆的防治仍无特效药物,临床上多为患者使用钙离子拮抗剂、胆碱酯酶抑制剂等治疗,但获得的治疗效果均达不到预期〔2〕。随着现代临床对中医药治疗的重视,结合中药独有的特性,有医家指出,可以为血管性痴呆使用中药治疗,具有多靶点、多环节、多方式、副作用少等特点〔3〕。白藜芦醇药理作用广泛,包括抗炎、神经保护、自由基清除、抗氧化、机体损伤保护、影响骨代谢等〔4〕。研究发现,白藜芦醇可以改善血管性痴呆大鼠空间认知功能损害,通过改善大鼠突触可塑性来发挥神经保护作用〔5〕。反式白藜芦醇是白藜芦醇的一种结构,研究发现,这种反式白藜芦醇对β-淀粉样肽(Aβ)致痴呆大鼠海马旁回有保护作用〔6〕。推测将其用于血管性痴呆的治疗也可获得一定神经元保护作用,但目前国内无相关研究可作为依据支持。本研究探讨反式白藜芦醇对血管性痴呆大鼠海马神经元的保护作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级雄性健康SD大鼠,由北京维通利华实验动物有限公司提供,合格证号为SCXK(京)2018-0010,周龄均为10 w,体重220~260〔平均(240±20)〕g,购回后放于实验室动物房内饲养。全部动物的采集与处理符合相关文件与文献中的规定〔7,8〕。

1.2主要用药与试剂 反式白藜芦醇,由陕西慈元生物技术有限公司生产提供,纯度为98%,批号为20180911;苦味酸,由广州华拓生物有效公司生产提供;荧光夜、RNAiso试剂液购自大连宝生物公司;DNA聚合酶优化引物、Caspase-3均购自上海生工生物工程有限公司;Aβ25~35由美国Sigma公司提供。

1.3主要仪器 脑立体定位仪,由深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供,实时荧光定量PCR分析仪由美国BIO-RAD公司提供,逆转录仪由德国EPPENDORF公司提供。

1.4方法

1.4.1血管性痴呆大鼠模型建立 方法〔9〕采用反复夹闭颈双侧总动脉合并腹腔内注射硝普钠的方式来制作模型。术前禁食12 h,腹腔注射适量的水合氯醛,颈部消毒,做切口将颈动脉分离,硝普钠腹腔注射。无创动脉夹阻断双侧颈总动脉血流,10 min后再灌注10 min,重复3次,在伤口上撒适量的青霉素粉末,伤口逐层缝合后回笼保温饲养。造模后1 d经跳台实验评价建模情况〔10〕。

1.4.2分组方法 随机将全部购入的54只大鼠中10只作为空白对照组,不进行建模;其他44只大鼠均建立血管性痴呆大鼠模型,最终建模成功40只。随机将建模成功的大鼠分为4组,各组10只,分别为模型组、低剂量反式白藜芦醇组(低剂量组)、中剂量反式白藜芦醇组(中剂量组)、高剂量反式白藜芦醇组(高剂量组)。

1.4.3给药方法 用0.9%氯化钠将反式白藜芦醇溶解为1%的反式白藜芦醇溶液,建模成功后,开始为大鼠灌胃给药,低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠的灌胃给药剂量分别为:10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d);空白对照组与模型组给予等体积的氯化钠注射液,共灌胃给药10 d。

1.4.4相关指标检查 (1)取材:在制模后第11天取材:使用10%水合氯醛将大鼠麻醉之后,断头、取脑,将大鼠的颅骨打开,迅速将海马组织取出,并放入滴加RNA萃取的1 ml EP试管内,在-80℃的环境下速冻保存待检。采用实时定量PCR方法检测。(2)相关指标检查:①苏木素-伊红染色观察大鼠海马病理改变:取大鼠脑组织,经石蜡包埋、切片后行苏木素-伊红染色,在光镜下观察各组大鼠海马的病理改变。②使用实时定量PCR测定大鼠海马区的DNA聚合酶γ及Caspase-3表达。根据试剂盒说明书详细操作提取并纯化DNA,测定DNA含量,进行逆转录与扩增。使用相关软件分析数据,统计目的基因相对表达量。③NMDAR1:a.Western印迹法测定海马神经元膜蛋白NMDAR1表达:成功分离各组海马神经元总膜蛋白,加入膜蛋白溶解液溶解,混合上样缓冲液与等量蛋白样品,浴锅加热10 min,电泳分离后封闭,与NMDAR1抗体、β-actin抗体在4℃条件下反应过夜,洗膜后与羊抗兔IgG室温下反应,使用软件分析,得到NMDAR1与β-actin比值,即NMDAR1/β-actin;b.免疫组化测定海马NMDAR1蛋白表达:石蜡切片脱腊复水,修复后冷却并冲洗,缓冲液浸泡3次,室温下孵育,封闭并滴加NMDAR1一抗,孵育过夜冲洗后显色,滴加二抗,孵育后显色、复染、脱水、透明、封片。使用光学显微镜观察,阳性表达即棕褐色。使用图像分析软件作半定量分析,随机选取每张切片5个海马区不重复视野,分别取值并得到平均值,以平均吸光度(IA)积分表示蛋白相对表达量。c.实时定量 PCR测定海马组织NMDAR1 mRNA表达量。

1.5统计学意义 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组海马组织病理形态 空白对照组海马区神经元形态、结构均无变化,均正常;模型组大鼠的海马区细胞层次清晰度不佳且数量明显变少,胞体缩小明显,细胞排列较散乱,有神经元丢失及核固缩的情况发生;反式白藜芦醇使用后,大鼠海马区细胞层次减少、细胞形态、排列稀松等情况有改善,见图1。

空白对照组

2.2各组海马组织Caspase-3、DNA聚合酶γ mRNA表达比较 空白对照组Caspase-3、DNA聚合酶γ mRNA表达最低,后由低至高依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组,模型组最高,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3各组海马神经元NMDAR1蛋白及mRNA表达比较 空白对照组NMDAR1蛋白及mRNA表达最低,后由低至高依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组,模型组最高,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1,图2。

表1 各组Caspase-3、DNA聚合酶γmRNA、海马神经元NMDAR1蛋白及mRNA表达比较

空白对照组

3 讨 论

血管性痴呆是主要痴呆类型,是目前唯一证实能够预防的痴呆类型,早期为患者制定合理干预治疗计划,对逆转患者病情有重要意义〔11〕。对于血管性痴呆的治疗,西医注重脑卒中的预防,并给予患者神经元保护、脑循环改善、脑代谢改善等诸多方面的治疗,以胆碱酯酶抑制剂、钙离子拮抗剂等为代表〔12〕。这些药物虽然可以改善患者认知功能,但却无法有效抑制患者神经细胞的迟发性坏死与继发性凋亡〔13〕。故血管性痴呆的防治仍是临床治疗的难点与热点。反式白藜芦醇是天然多酚类植物保卫素,有着抗老年痴呆、抗肿瘤、抗细菌、抗真菌等诸多生物活性,是理想先导化合物,与反式白藜芦醇类似物相关的动物实验中也证实了其具有的理想的生物活性〔14〕。反式白藜芦醇是白藜芦醇的主要结构之一,较白藜芦醇的另一结构——顺式白藜芦醇具有更强的生活性,尤其是在氧化、抗自由基作用方面已被证实并受到认可〔15〕。在2015年,王刚等〔16〕建立了阿尔茨海默病小鼠模型,给予模型反式白藜芦醇治疗,结果显示,反式白藜芦醇对阿尔茨海默病小鼠模型的学习记忆改善效果理想,且这种记忆改善效果随着反式白藜芦醇使用剂量的增加而增加。上述结果间接反映了反式白藜芦醇治疗血管性痴呆的可能性。Caspase-3是Csapases级联反应下关键的凋亡程度之一,起到最终枢纽的作用;而DNA聚合酶γ则是已知的DNA聚合酶中唯一在线粒体有表达并参与复制、修复线粒体DNA的酶,二者表达的变化与神经元损伤情况有关〔17〕;NMDAR是离子型谷氨酸受体,一方面参加了中枢神经的学习与记忆功能,另一方面参与了脑局部缺氧缺血时谷氨酸的兴奋性毒性反应,在脑局部缺血性损伤过程中,其在细胞间隙谷氨酸中过表达为主要表现,激活的NMDAR会导致细胞膜内外离子平衡被破坏,从而诱发神经毒性效应,进一步加重神经细胞损伤程度及死亡〔18〕。可见NMDAR的高表达可能提示神经元的损伤或老化。本研究结果提示反式白藜芦醇对血管性痴呆患者海马神经元有保护作用,而这种保护作用可能通过抑制或下调Caspase-3、DNA聚合酶γmRNA与NMDAR1表达来实现。因目前尚无较多研究可以为本研究提供依据,也无较多可作比较的文献,因此本研究结果的真实性与可靠性可能有偏差,还需要在未来多进行实验研究加以证实。

综上所述,反式白藜芦醇可能通过下调血管性痴呆大鼠海马区神经元NMDAR1、Caspase-3及DNA聚合酶γ表达,来发挥海马神经元保护之效。

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