老年乳腺癌患者新辅助化疗后原发灶与转移灶肿瘤标志物表达比较

周祥敏 郑元停 (三亚市妇幼保健院检验科，海南 三亚 572000)

早期乳腺癌患者不会出现特异性临床表现和体征，导致大部分患者就诊时病情已发展至中晚期。此外，由于老年患者各器官功能逐渐衰退，机体免疫力和抵抗力降低，相较于中青年乳腺癌患者，一般预后较差〔1,2〕。新辅助化疗是临床治疗局部晚期乳腺癌或使肿瘤缩小后争取保留乳房手术的有效手段，与传统辅助化疗相较而言，新辅助化疗更有利于降低肿瘤分期，提高手术和保留乳房的概率，可有效控制癌细胞向全身扩散，从而提高生存期〔3〕。有研究表明，乳腺癌原发灶和转移灶中的分子标志物表达水平不同，且临床治疗方案存在一定差异性〔4〕。本研究旨在探讨老年乳腺癌患者新辅助化疗后原发灶与转移灶肿瘤标志物的表达情况。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2019年1～7月于三亚市妇幼保健院接受新辅助化疗的老年乳腺癌患者82例的临床资料。年龄61～79岁，平均(69.42±2.74)岁；体重指数17～27 kg/m2，平均(23.42±1.12)kg/m2；文化程度：17例初中及以下，36例高中/中专，29例大专及以上；浸润性导管癌67例，浸润性小叶癌15例。纳入标准：①符合《中国老年乳腺癌治疗专家共识(2018)》〔5〕内相关诊断标准，且经病理学检查确诊者；②认知功能正常。排除标准：①精神疾病史；②合并其他恶性肿瘤；③免疫系统疾病；④血液系统疾病；⑤合并心、肝、肾等重要脏器功能严重损害。

1.2方法 所有患者接受新辅助化疗后的肿瘤组织标本，采取完毕后需在离体30 min内送至检查，以5 mm为间距将大体标本切开，并将其放置固定于10倍体积的4%中性甲醛缓冲溶液中，时间6～48 h，进行常规石蜡包埋等操作，5 μm切片。选用3%过氧化氢(H2O2)室温温育5～10 min，对内源性过氧化物酶的活性进行灭活，并给予磷酸盐缓冲液(PBS)进行冲洗，重复3次，2 min/次；之后分别将Ki-67、人表皮生长因子受体(HER)2及孕激素受体(PR)一抗工作液滴加入，在37℃环境下进行温育，温育时间1～2 h，或在4℃环境下过夜；再给予PBS进行冲洗，共3次，2 min/次，将聚合物辅助剂(Polymer Helper)滴入，室温或37℃室温温育20 min，给予PBS冲洗，共3次，2 min/次，滴加多聚过氧化物酶抗鼠及抗兔抗体，室温或室温37℃温育20～30 min，再次采用PBS冲洗，共3次，2 min/次。最后选用二氨基联苯胺(DAB)显色液进行显色，4～8 min，再给予自来水进行反复冲洗，苏木素复染、脱水透明、封片，并采用显微镜进行观察。雌激素受体(ER)、PR及Ki-67采用全自动免疫组化染色机(上海精密仪器仪表有限公司，型号：MY2300)进行染色评估，且采用乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液进行抗原修复，修复时间为20 min。根据《ASCO/CAP 乳腺癌激素受体 IHC检测指南》〔6〕中标准作为ER、PR结果判断阳性细胞标准：阳性细胞百分数及阳性强度≥1%肿瘤细胞核阳性为阳性，若肿瘤细胞核染色<1%为受体阴性表达。采用美国Abbott公司所提供的双探针试剂盒及全自动免疫组化机(徕卡显微系统(上海)贸易有限公司，型号：BOND MAX)对HER2受体进行检测评估，常规脱蜡、抗原修复，并在37℃环境下温育24 min，苏木精复染。采用ASCO/CAP指南标准〔7〕判定：无着色细胞或10%肿瘤细胞呈模糊不清/微弱、不完整的细胞膜着色为阴性；存在高于10%的肿瘤细胞为弱至中等强度和(或)不完整细胞膜着色，或存在不高于10%的肿瘤细胞呈强度、完整细胞膜着色为不确定；多于10%细胞呈强度、完整细胞膜着色为阳性。对(不确定)的患者进行光原位杂交(FISH)检测，依据组织学及免疫组织化学切片定位，选取4 mm×4 mm的浸润癌组织，当切片不均匀染色时，选取不同代表区域对比例进行记录。处理石蜡切片，选用80℃、1 mmol/L硫氰酸钠(NaSCN)液进行热修复，修复时间为30 min，0.1 mg/ml蛋白酶K 37℃消化10 min，采用核酸杂交漂洗液对切片进行漂洗，漂洗时间5 min，在室温环境下干燥切片；将10 μl杂交液滴入，放置于杂交仪中孵育16 h，温度为42℃。切片经0.1%NP-40/2×SSC洗涤5 min，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染细胞核。观察切片，并对图像进行采集。每张切片需确保至少4个区域、共20～80个浸润性乳腺癌肿瘤细胞，对每个细胞核HER2及CEPl7信号数量进行记录，计算HER2、17号染色体着丝粒探针(CEP17)的平均拷贝数及HER2/CEP17比值。并对其阴阳性进行判断，阴性：HER2/CEP17<2.0且HER2平均拷贝数<4.0；不确定：HER2/CEP17<2.0且4.0≤HER2平均拷贝数<6.0；阳性：HER2/CEP17≥2.0或HER2平均拷贝数≥6.0。Ki-67判定标准依据St．Gallen国际乳腺癌会议共识进行判断〔8〕，低表达：Ki-67<14%；高表达：Ki-67≥14%。

2 结 果

2例乳腺癌原发灶与转移灶ER存在表达差异，2例乳腺癌原发灶为阳性，而转移灶为阴性。7例乳腺癌原发灶与转移灶PR存在表达差异，5例乳腺癌原发灶为阳性，而转移灶为阴性；2例乳腺癌原发灶为阴性，而转移灶为阳性。3例乳腺癌原发灶与转移灶HER2存在表达差异，1例乳腺癌原发灶为阳性，而转移灶为阴性；2例乳腺癌原发灶为阴性，而转移灶为阳性。17例乳腺癌原发灶与转移灶Ki-67存在表达差异，14例乳腺癌原发灶为阳性，而转移灶为阴性；3例乳腺癌原发灶为阴性，而转移灶为阳性。见表1。

表1 乳腺癌原发灶及转移灶中ER、PR、HER2、Ki-67表达变化(n)

3 讨 论

乳腺癌是女性群体中高发的一种恶性肿瘤疾病，主要在老年女性群体中多见，且发病率及死亡率目前仍呈逐年递增及年轻化趋势，现已成为危害女性健康的重要疾病之一。乳腺癌的发生及发展过程与性激素具有密切关系，而激素受体的发现是乳腺癌治疗史上的里程碑之一〔9,10〕。

ER是一种与雌二醇结合后形成的蛋白分子，可与雌激素相互结合后形成复合物，且可转向细胞内，能够参与基因转录、蛋白合成和细胞的分裂增殖等多种生理过程中。PR是核受体超家族中的一种甾体激素受体，ER的表达水平与乳腺癌患者接受内分泌治疗的治疗效果具有紧密关系，对两种受体进行检测能够对患者接受内分泌治疗的情况进行精准反馈，其检测结果对制定、选择治疗方案具有重要影响〔11〕。不同类型肿瘤存在原位癌演变为浸润癌，原发肿瘤随着时间的自身演变及原发灶向转移灶发展等3种情况的时间异质性〔12,13〕。临床认为造成这种异质性的原因较多，如标本不同、实验室条件差异及不同检测方法等客观因素可能会造成人为误差，而肿瘤生物学特性发生变化、以往治疗史及受体之间的相互作用也会造成差异性。有研究表明，2/3的50岁以下乳腺癌患者可见ER或PR呈阳性表达，而50岁以上的乳腺癌患者中有80%可见ER阳性，表明ER和PR是乳腺癌患者临床治疗过程中对预测及预后进行观察的两项重要参考指标〔14〕。

HER2是目前研究较为透彻的乳腺癌基因之一，主要由922个腺嘌呤、1 382个胞嘧啶、1 346个鸟嘌呤及880个胸腺嘧啶构成〔15〕。HER2蛋白是一种跨膜蛋白，具有一定的络氨酸蛋白激酶活性，目前临床认为HER2基因扩增是影响乳腺癌生长与转移的重要因素之一，约有30%的乳腺癌患者中存在HER2基因过度表达，且与患者预后情况较差具有密切关联。当乳腺癌患者HER2过度表达时，可促进患者的病情发展，化疗缓解期缩短且内分泌的治疗效果较差，生存率较低〔16〕。Ki-67是预测乳腺癌预后的重要参考指标之一，可对肿瘤组织细胞增殖活性、组织细胞良恶性生长状态进行反馈，有助于确定是否采用辅助性化学治疗〔17〕。新辅助化疗是临床治疗乳腺癌过程中较为重要的一个环节，是局部晚期乳腺癌的首选治疗手段，现也常用于治疗存在淋巴结转移的乳腺癌患者及无法行保乳术但有保乳意愿的患者〔18〕。本研究结果表明老年乳腺癌患者新辅助化疗后原发灶与转移灶ER、PR、HER2及Ki-67肿瘤标志物表达水平存在差异，可实时对上述肿瘤标志物进行监测，以对患者进行最佳救治。