miR-335-5p和转录因子ATF2在宫颈癌中的表达关系研究

冉 伟， 廖 萍， 刘兴兰， 马晓洁

(川北医学院附属医院， 四川 南充 637000)

宫颈癌是妇科常见的生殖系统恶性肿瘤，我国每年的宫颈癌新增病例远高于发达国家，近年来的发病状况趋于年轻化[1]。人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要发病原因，尤其是HPV16和HPV18在诱发宫颈癌中扮演重要角色，但婚育情况、遗传因素等也可能会诱发宫颈癌[2]。微小RNA(micro RNA，miRNA)是长度为22～24nt的非编码单链RNA，其在多种肿瘤疾病中起到抑癌或致癌的作用，参与肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭和凋亡等[3]。研究发现微小RNA-335-5p(micro RNA-335-5p，miR-335-5p)在多种肿瘤中具有不同的作用，在乳腺癌中表达呈下降趋势[4]，而在非小细胞肺癌中表达上调[5]，但其在宫颈癌中的表达及作用鲜少有报道。激活转录因子2(activating transcription factor 2，ATF2)是ATF/CREB家族的成员，具有碱性-亮氨酸拉链结构[6]。ATF2能被多种细胞途径应激和细胞因子刺激所激活，如病毒感染、DNA损伤和细胞凋亡等。研究显示，ATF2可参与肿瘤的发生发展，在胰腺癌细胞系中表达上调，抑制细胞周期G1/S，减缓细胞的增殖，但其对宫颈癌的影响方式尚未明确[7]。本研究将通过检测miR-335-5p和ATF2在宫颈癌中的表达情况，分析二者之间的关系及对宫颈癌的影响。

1 资料与方法

1.1临床资料:选取2017年8月至2019年10月在本院进行手术治疗的72例宫颈癌患者作为实验组，年龄33～75岁，平均年龄(48.32±11.53)岁；选择同期进行手术治疗的65例子宫肌瘤患者作为对照组，年龄35～74岁，平均年龄(46.86±10.37)岁，两组患者的一般资料比较无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：①经病理检查确诊；②首次进行手术治疗的患者；③术前3个月未进行放疗或化疗者；④患者及家属知晓本研究内容，均签署知情同意书。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；②合并患有其他系统疾病者；③自身免疫疾病者。本研究经川北医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2主要试剂与仪器:RNA提取试剂盒(货号：12183020)、反转录试剂盒(货号：4368813)均购自于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；qRT-PCR试剂盒(货号：FP304-01)购自北京天根生化有限公司；ATF2兔抗人多克隆抗体(货号：CM-07094)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP2)兔抗人多克隆抗体(货号：CM-0348)均购自美国Labvision生物公司。Bio-Rad PCR仪(型号：S1000)购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.3方 法

1.3.1样品采集:收集手术切除的宫颈癌癌组织和子宫肌瘤患者的宫颈组织，将样本分为两部分，一部分经石蜡包埋，制备成石蜡切片，另一部分置于-80℃冰箱保存以备后续使用。

1.3.2实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)法测定miR-335-5p、ATF2 mRNA及MMP2 mRNA的表达量:取出保存的样本，提取总RNA：对样本超声匀浆，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，检测RNA纯度并用琼脂糖凝胶电泳检测其完整度；逆转录反应：将所得RNA按照反转录试剂盒说明操作，反转录为cDNA，产物置于-20℃冰箱保存备用。实时荧光定量PCR：反应体系20μL，10 μL 2×SYBR Mix，上下游引物各1 μL，cDNA模板2μL，H2O 6μL，每个样品做3个重复，反应条件为95℃反应45s，95℃反应10 s、60℃反应30 s，35个循环，72℃延伸10 min，在qPCR仪上进行反应。miR-335-5p以U6为内参；ATF2及MMP2均以β-actin为内参。引物均由宝日医生物技术(北京)有限公司合成。使用ΔΔCt法对结果进行相对定量分析，根据各样本的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法计算miR-335-5p、ATF2 mRNA及MMP2 mRNA的相对表达量。miR-335-5p、ATF2、MMP2及内参基因β-actin、U6的引物序列见表1。

表1 miR-335-5p ATF2 MMP2及内参基因β-actin U6的引物序列

1.3.3免疫组化检测宫颈癌组织中ATF2蛋白和MMP2蛋白的表达情况:将石蜡切片脱蜡后，分别在梯度乙醇中孵育2～3min，经蒸馏水漂洗后在3%H2O2中常温孵育15min，抗原热修复，在柠檬酸盐缓冲液中加热5min，经PBS溶液清洗，加入山羊血清孵育20min，滴加适当比例稀释的一抗湿盒中孵育过夜，PBS清洗3遍，加入对应的二抗孵育30min，PBS溶液清洗，DBA显色液进行显色反应，染色成功后，蒸馏水冲洗，在苏木素中复染1min，蒸馏水冲洗后置于1%盐酸中10s，再用蒸馏水冲洗，最后分别置于梯度乙醇中脱水2-3min，经透明处理后，封片镜检。ATF2定位于细胞核，阳性表达细胞核有棕黄色颗粒，阴性表达则细胞不染色；MMP2定位于细胞浆，阳性表达细胞浆呈棕黄色，阴性表达则细胞不染色。

2 结 果

2.1qRT-PCR检测两组miR-335-5p、ATF2 mRNA及MMP2 mRNA的表达情况:实验组miR-335-5p、ATF2 mRNA及MMP2 mRNA的表达量均明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组miR-335-5p ATF2 mRNA及MMP2 mRNA水平比较

2.2两组ATF2蛋白和MMP2蛋白的表达情况:实验组ATF2蛋白的阳性表达率为56.94%，明显高于对照组43.06%(P<0.05)；MMP2蛋白的阳性表达率为45.83%，明显高于对照组6.15%(P<0.05)。见表3。

表3 宫颈癌组织中ATF2和MMP2蛋白阳性表达率 n(%)

2.3宫颈癌患者miR-335-5p、ATF2及MMP2表达与临床病理特征的关系:根据实验组miR-335-5p表达水平的中位值将其分为两组，其中高表达组共37例，低表达共35例。宫颈癌患者癌组织中miR-335-5p、ATF2及MMP2的表达水平与年龄、肿瘤直径无关(P>0.05)；miR-335-5p、ATF2及MMP2的表达水平与FIGO分期、浸润深度及淋巴结转移有关(P<0.05)。见表4。

表4 宫颈癌患者miR-335-5p ATF2及MMP2表达与临床病理特征的关系n(%)

2.4影响宫颈癌的多因素分析:将宫颈癌是否发生作为因变量，以FIGO分期、浸润深度、淋巴结转移、miR-335-5p、ATF2及MMP2作为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示miR-335-5p、ATF2及MMP2均为影响宫颈癌的危险因素，见表5。

表5 影响宫颈癌的多因素分析

2.5宫颈癌癌组织中miR-335-5p、ATF2及MMP2表达的相关性:Pearson法分析结果显示，宫颈癌患者癌组织中miR-335-5p与MMP2的表达呈明显正相关(r= 0.490，P<0.05)，见图1；ATF2与MMP2的表达呈明显正相关(r=0.424，P<0.05)，见图2；miR-335-5p与ATF2的表达呈明显正相关(r=0.860，P<0.05)，见图3。

图1 宫颈癌癌组织中miR-335-5p、MMP2表达的相关性

图2 宫颈癌癌组织中ATF2、MMP2表达的相关性

图3 宫颈癌癌组织中miR-335-5p、ATF2表达的相关性

3 讨 论

miRNA可调控一个或多个信使RNA，从而调控其编码的蛋白质，在细胞形成的过程中起重要作用。大量研究证明，不同的miRNA在肿瘤中异常表达，具有抑癌或致癌的作用，在疾病的发展进程中发挥不同的作用[8]。miRNA可作为肿瘤诊断、治疗及预后的标志物，是近年来的研究热点。miR-335-5p位于人染色体7q32.2处，可调节细胞的生理活动，在人体组织器官中广泛表达，并在多种肿瘤中异常表达，发挥抑癌或促癌作用[9]。研究表明，miR-335-5p能抑制Bcl-w蛋白表达，从而抑制MMP2蛋白表达，在卵巢癌中发挥抑癌作用[10]。而本研究结果显示，实验组中miR-335-5p表达水平均明显高于对照组，提示miR-335-5p可能参与宫颈癌的发生发展。另外本研究通过进一步分析miR-335-5p表达水平与临床病理特征的关系分析显示，宫颈癌患者癌组织miR-335-5p与FIGO分期、浸润深度及淋巴结转移有关，此结果进一步说明miR-335-5p参与宫颈癌的发生发展，且与疾病的侵袭转移密切相关。

ATF2位于人染色体2q32处，含有两个功能结构域：氨基端反式激活域和羧基端DNA结合域。ATF2在人体内各组织器官中表达量不尽相同，在脑组织中表达最高。研究表明，ATF2参与细胞生理活动，如染色质重塑、DNA损伤应答、转录调节等，在肿瘤中发挥致癌或抑癌的作用[11]。有报道称，下调ATF2的表达可抑制结肠癌细胞侵袭和迁移[12]。另有研究显示，ATF2磷酸化可激活器下游的靶蛋白泛素特异性蛋白酶14，从而促使前列腺癌细胞侵袭和迁移[13]。而本研究结果显示，实验组中ATF2 mRNA和MMP2 mRNA的表达水平均明显高于对照组，且实验组ATF2蛋白和MMP2蛋白的阳性表达率明显高于对照组，提示ATF2和MMP2可能参与宫颈癌的发生发展；同时宫颈癌患者癌组织ATF2和MMP2的表达水平均与FIGO分期、浸润深度及淋巴结转移有关。另外通过对宫颈癌患者进行Logistic多因素回归分析，miR-335-5p、ATF2和MMP2均是影响宫颈癌的危险因素，提示下调miR-335-5p、ATF2和MMP2的表达可能会对宫颈癌起到抑制作用；宫颈癌组织中miR-335-5p、ATF2和MMP2三者的表达量两两间均呈正相关，提示三者之间可能存在有相互调控机制，共同作用影响宫颈癌的发生发展。

综上所述，miR-335-5p、ATF2在宫颈癌组织中表达上调，二者的表达水平与FIGO分期、浸润深度及淋巴结转移有关，且二者可能共同作用影响宫颈癌的发生发展。但本次研究的不足之处在于纳入的样本量较少，日后会继续收集样本，扩大样本量，对miR-335-5p、ATF2与子宫肌瘤的发生发展进行深入研究，期望日后可为宫颈癌的临床诊断及治疗提供更有价值的参考依据。