金黄色葡萄球菌骨髓炎发病机制的研究进展

文强强，刘岩，苏子龙，于铁成

(吉林大学第一医院创伤骨科，吉林 长春 130021)

金黄色葡萄球菌作为一种机会性致病菌，可导致包括骨感染在内的多种感染性疾病。在临床上，金黄色葡萄球菌是骨感染最主要的致病菌[1-2]。骨组织在感染金黄色葡萄球菌后如果不能及时得到治疗，感染便会很快转变为慢性，并且很难彻底治愈，造成反复感染。这与金黄色葡萄球菌感染骨组织的特点密切相关。首先，金黄色葡萄球菌在感染骨组织后可以接触成骨细胞并内化进入细胞内长期存活，在这期间它会对骨组织造成严重的破坏。其次，金黄色葡萄球菌可以在病灶内或者植入物表面形成细菌生物膜。细菌的内化和生物膜的形成使得机体免疫和抗生素不能彻底清除细菌，使急性感染转变为慢性反复感染。因此具体的了解这两大特点是很有必要的，因为这将有助于选择合适的治疗措施去干扰骨感染的病理进程，从而彻底治愈骨髓炎。

1 金黄色葡萄球菌内化进入成骨细胞

金黄色葡萄球菌感染骨组织后能够接触并内化进入成骨细胞，并在成骨细胞中持久存活，从而实现对机体免疫系统的逃避，对成骨细胞和破骨细胞产生各种影响，当成骨细胞被死亡或凋亡后，其内的细菌又会重新释放到组织间隙中感染别的正常成骨细胞，从而造成反复感染。

金黄色葡萄球菌能够内化进入成骨细胞与其表面的细胞壁锚定(cell wall anchored，CWA)蛋白密切相关[3]。在这些CWA蛋白中，黏附性基质分子表面识别因子是最大的一类，其中涉及内化黏附过程的主要包括胶原黏附素(collagen adhesin，Cna)、骨唾液蛋白结合蛋白(bone sialo protein binding protein，Bbp)、Map(MHC Ⅱ analog protein，一种与哺乳动物MHC Ⅱ类分子类似的功能性蛋白)和纤连蛋白结合蛋白(the fibronectin binding proteins，FnBPs)[4]。金黄色葡萄球菌主要是通过CWA蛋白黏附到成骨细胞表面的，然而这种黏附不是直接的，是通过骨细胞外基质(bone extracellular matrix，BEM)间接进行的(见图1)。BEM是金黄色葡萄球菌感染中的一个重要的角色，它由成骨细胞产生，并且为金黄色葡萄球菌集中在成骨细胞附近创造了条件。BEM中与内化黏附有关的成分主要包括I型胶原、骨唾液蛋白、骨桥蛋白和纤维连接蛋白。

金黄色葡萄球菌表面的Cna主要与Ⅰ型胶原结合，Bbp与骨唾液蛋白结合。有研究发现金黄色葡萄球菌中Cna和Bbp基因的存在是植入相关性骨髓炎分离物毒性的主要指标[4]。金黄色葡萄球菌的Map(MHC Ⅱ analog protein，一种与哺乳动物MHC Ⅱ类分子类似的功能性蛋白)在骨髓炎中的作用可能与骨桥蛋白的结合有关[5]。纤维连接蛋白是金黄色葡萄球菌和成骨细胞之间的桥梁。一方面，金黄色葡萄球菌表面的FnBPs与纤维连接蛋白结合；另一方面，纤维连接蛋白通过整合蛋白α5β1连接到成骨细胞上[6]。FnBPs通过I型胶原与α5β1整合蛋白结合，是金黄色葡萄球菌通过细胞内摄作用进入成骨细胞内部的主要途径[7]。

金黄色葡萄球菌内化进入成骨细胞后可以在其内长期存活，这主要与两个因素有关[4](见图2)。第一，囊泡逃逸。金黄色葡萄球菌的内化在巨噬细胞中高于成骨细胞，但在成骨细胞中存活的金黄色葡萄球菌的比例高于巨噬细胞。这是因为作为非专业的吞噬细胞，其不具有清除囊泡内细菌的能力，而进入成骨细胞内金黄色葡萄球菌可以躲在囊泡里，以成功的避免溶酶体的蛋白水解酶的处理，使得金黄色葡萄球菌可以在成骨细胞内存活很长时间[8]。第二，小菌落变异体(small colony variants，SCVs)。金黄色葡萄球菌在内化进入细胞后，为了躲避机体免疫系统的攻击，它们会从野生侵袭型转变为毒性较小的SCVs型。SCVs是一种生长缓慢的细菌亚群，其细胞壁更厚，具有更高的细胞内持久性，对抗生素的敏感性更低，这可能与其有较低的细胞毒性有关[9]。虽然SCV分泌较少的毒性因子，但其表面的CWA蛋白却是过量表达的[10]。有研究发现，金黄色葡萄球菌的SigB基因与SCVs的形成[10]密切相关，而很早以前就发现SigB基因与生物膜的成熟[11]也有关系。此外，SCVs在离开原来的细胞并感染新的细胞时会迅速恢复为完全的野生的高毒性侵袭型[12]，这也从另一方面解释了慢性骨髓炎患者为什么会反复感染。

金黄色葡萄球菌感染成骨细胞后，成骨细胞便会分泌细胞因子、趋化因子和生长因子等炎性因子来参与免疫反应，虽然这些炎性因子一定程度上有对抗细菌入侵的作用，但过多的分泌可能会破坏免疫系统的平衡，从而导致骨破坏[13]。成骨细胞不仅能参与炎症反应，同时还可以释放α防御素、β防御素和相关分子的抗菌肽(antimicrobial peptides，APs)来抵御金黄色葡萄球菌的入侵[14]。因此，外源性APs的使用可能是治疗金黄色葡萄球菌感染相关性骨髓炎的一种新的有效方法，此外，它们还可以被添加到类似钛合金的支架中，从而扩大了它们用于对抗植入性骨髓炎的用途[4]。

图1 金黄色葡萄球菌黏附阶段的示意图 图2 金黄色葡萄球菌进入成骨细胞过程示意图

2 细菌生物膜的形成

骨髓炎抗生素难治的另一个原因便是细菌生物膜的存在。细菌生物膜的形成是细菌适应生存环境的两种方式之一，另一种表现形式是以浮游细胞的形式存在。在实验室培养基中，由于营养条件充分，细菌主要是以浮游细胞的形式存在的，但在体内的实际感染过程中，特别是当有植入物时营养条件往往是不充分的，这时细菌便会形成生物膜[15]，它将细胞包裹在一种粘性基质中，便于其在恶劣极端的环境中生存。生物膜由细菌外多糖和外源性物质(多糖、蛋白质、矿物晶体、细胞外DNA等)组成[16]，在不同的金黄色葡萄球菌分离株中发现，其生物膜的成分比例是不同的[17]，但最主要的成分是多糖细胞间粘附素(polysaccharide intercellular adhesin，PIA)，其也是生物膜形成黏附和聚集阶段最重要的物质基础，是由icaADBC位点的基因构成的操纵子合成的[18]。

细菌形成生物被膜是一个动态的过程，主要可分为四个阶段：细菌可逆性粘附的定殖阶段、不可逆性粘附的集聚阶段、生物被膜成熟阶段和细菌的脱落与再定植阶段[19](见图3)。也有一些文献把这一过程分为3个阶段[20]或5个阶段[21]，但其本质并没有什么区别，只是个别过程的细化或概括。在最初的附着过程中，单个浮游细菌会可逆地与组织或植入物表面结合，如果细胞长时间不被游离，黏附就会进入不可逆阶段。金黄色葡萄球菌生物膜形成黏附阶段也与细菌表面的CWA和BEM中的相关成分有关[22]，这一过程与细菌内化过程中的黏附阶段极为相似，也是通过细胞外基质中的成分发挥作用的。其中一些蛋白如FnBPs、ClfB和SdrC蛋白不仅在黏附阶段起作用，在随后细菌增殖的过程中也发挥着重要的作用[21]。但是和机体组织表面生物膜的形成相比，发现植入物表面的生物膜黏附与CWA蛋白的关系并不是太大[21]。植入物表面生物膜的黏附形成不仅依靠细胞外基质中成分发挥中介作用，也依靠范德瓦尔斯力、静电和空间相互作用力的作用[23]。生物膜的成熟是通过细胞分裂和细胞外聚合物基质的产生来实现的。随着生物膜的积累，生物膜内会累积大量的代谢废物，并且营养物质也会耗竭，这时，生物膜便会启动自我降解程序，群体感应系统、促降解酶和其他特殊化合物会降解生物膜中细胞外多糖、细胞外蛋白质和eDNA等成分，造成细胞膜破裂，其内的细菌再次恢复到浮游状态进行扩散，从而造成反复的感染[18]。同时这也给了生物膜的清除治疗一定的启示，是否可以人工促进生物膜降解同时配合抗生素的治疗。

生物膜可有效保护细菌免受机体免疫和抗生素的清除。发现巨噬细胞等免疫细胞很难通过生物膜，这就使得机体免疫受阻[24]。生物膜的耐药性主要有两种机制：其一，生物膜本身可以阻止抗生素进入其内部；其二，与细胞内的SCVs相似，生物膜内的细菌也会形成一种保守的低毒性的表型，其代谢比野生型细菌低，对抗生素有很强的抵抗力[18]。要想抑制生物膜的形成或者清除已经形成的生物膜，那么抗生素治疗剂量可能需要达到平时的数倍或数十倍。比如对于万古霉素，其最低抑制生物膜形成浓度(minimumbiofilminhibition concentrations，MBIC)是其最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentrations，MIC)的2～8倍，而最低清除生物膜浓度(minimum biofilm eradication concentrations，MBEC)至少是其MIC的16倍。对于利奈唑胺，单其MBIC就是MIC的32倍[20]，而抗生素如果达到MBIC和MBEC的量，将会对机体产生巨大的毒副作用。而大多数治疗量的抗生素，其只能在生物膜形成的早期阶段进入生物膜内杀死细菌，并且这段时间仅持续几天时间[25]。

a 可逆性黏附的定殖阶段 b 不可逆性黏附的集聚阶段 c 生物被膜成熟阶段阶段 d 细菌的脱落与再定植阶段

3 骨质破坏

金黄色葡萄球菌对骨组织最主要的影响是能够造成严重的骨质流失，造成骨质破坏，这种现象的原因是由于成骨细胞和破骨细胞之间的不平衡所引起的。成骨细胞和破骨细胞分别负责骨形成和骨吸收，这对于骨稳态非常重要。无论是哪一方面出现问题，都会破坏正常骨稳态环境。成骨细胞可以分泌产生NF-κB的配体受体激活蛋白(receptor activator of NF-k B ligand，RANK-L)和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)，并以此来调节破骨细胞的生成，RANK-L/OPG比值过高便会刺激破骨细胞的生成，相反破骨细胞的生成便会减少[26]。

在金黄色葡萄球菌造成的骨感染中，成骨细胞活性降低，最后会凋亡和死亡，骨形成减少；相反，破骨细胞活性增强，骨吸收增加，从而导致骨质流失，骨质破坏。这一骨质的变化不仅发生在细菌内化过程中[4]，也会发生在生物膜形成阶段[27]。这提示骨感染骨质的破坏是这两方面共同作用的结果，而不是单因素造成的。以浮游形式存在的细菌或内化过程中的细菌对成骨细胞产生的影响主要是由于其表面的毒力因子引起的[28]，而生物膜对成骨细胞的影响主要是通过其产生的可溶性因子发挥作用的[27]。同时发现两者都是通过提高RANK-L/OPG的比值，刺激破骨细胞的生成[27，29-30]，从而造成骨质流失。

4 骨感染治疗的展望

目前，骨感染的治疗主要遵循三个基本原则[31]：(1)抗生素的应用；(2)局部外科清创；(3)使用辅助治疗。由于抗生素很难进入细胞和生物膜内，难以彻底清除细胞和生物膜内的细菌，这就导致了耐药菌的产生以及骨感染的反复发作。彻底清除感染组织是治疗的关键，如果手术清创范围过小，则不能达到彻底清除坏死病灶的目的，会残留细菌在体内，有复发的可能；而清创范围过大则会对患者造成巨大的伤害，使患者的生活质量大大降低[32]。辅助治疗如高压氧等，是一种辅助疗法，只能配合其他治疗手段使用。这就导致目前临床上骨感染难以彻底治愈的局面，因此，迫切需要开发新的治疗方法来治疗这种顽固性疾病。由于骨感染中阻碍治疗的主要是细菌内化和生物膜的存在，那么针对这两点的治疗将会给予骨感染治疗新的希望。

对于金黄色葡萄球菌的内化，由于CWA蛋白在其黏附阶段和内化阶段都发挥着重要的作用，因此预防阶段可以使用针对CWA蛋白的重组疫苗[3]进行预防。而对于已经内化进入细胞内的细菌，现阶段研究的热点主要是研制各种措施增加抗生素进入细胞内的量，比如纳米粒子颗粒负载抗生素的应用[33]，有研究发现其也能穿透细菌生物膜[34]。同时发现沙氏菌蛋白酶可以减少金黄色葡萄球菌对成骨细胞的侵袭内化作用[35]。

对于生物体组织表面生物膜的形成，由于其黏附和金黄色葡萄球菌表面的CWA蛋白密切相关，因此也可以给予重组的CWA蛋白疫苗。而对于预防植入物表面生物膜的形成，可以应用一些表面涂有特殊抗菌涂层或抗黏附涂层的医用新型植入物[36]。虽然单种抗生素应用很难对抗生物膜，但研究发现多种抗生素的联合应用对生物膜有很好的治疗效果[37]。最近发现一些抗菌肽的衍生物对生物膜也有作用[38-40]。植物乳酸杆菌分泌的脂磷壁酸(lipoteichoicacid，LTA)不仅可以抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，还可以破坏预先形成的生物膜[41]。此外，一些物理方法和抗生素的联合应用也发现对生物膜的形成或清除有一定的作用，比如纳米粒子颗粒[34]、冲击波[42]和光动力疗法[43]等。

综上所述，虽然以上针对细菌内化和生物膜的治疗大多仍处于实验阶段，并没有进入临床，但这些治疗方法在未来的应用将会把骨感染治疗提上一个新的高度。