电子鼻结合GC-MS分析不同处理蓝莓货架期间果实的挥发性成分

薛友林,董立超,张 鹏,李春媛,李江阔

(1.辽宁大学轻型产业学院,辽宁沈阳 110036;2.国家农产品保鲜工程技术研究中心(天津),农业农村部农产品贮藏保鲜重点实验室,天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室,天津 300384)

蓝莓又名越橘,因其是深蓝色的小浆果类也被叫作蓝浆果，属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vac-cinium)植物,蓝莓中含有丰富的花青素、黄酮、酚、醛等成分[1],蓝莓中因有预防癌症糖尿病、神经衰退清除抗氧化自由基等功能为人们所熟知[2]。蓝莓果实为圆形,成熟果实口感细腻,风味独特,营养丰富,堪称“世界水果之王”,被联合国粮农组织列为人类五大健康食品之一[3]。但是蓝莓果实不耐贮存,果实腐败后常产生不愉快气味,电子鼻是一种新型仿生技术,通过模拟动物嗅觉系统,收集食品样品气味的指纹数据来实现品质评价,其具有准确度高、重复性好、不存在人的主观臆断的特点而优于感官评价,广泛应用于食品领域,尤其是在果蔬保鲜领域中是一种非常好的无损检测方法[4],通过与顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用可分析鉴定面包、线椒、海参、竹叶等挥发性成分变化[5-8]。

中国对于蓝莓的贮藏保鲜已研究出多种方法,最常用是低温、CAP、MAP、1-MCP等方法的联合处理[9-11]。但对于贮藏后的销售过程,国内学者研究较少,常温放置的蓝莓存放2～3 d品质就会劣变,目前针对超市中的蓝莓保鲜,在销售过程中大多放置低温货柜内保藏,采取塑料盒包装结合低温的保鲜模式。目前学者们对蓝莓货架期内挥发性成分的报道较少,且大多是从生理、品质指标分析蓝莓货架期间成分变化,本实验以不同保鲜方法冰温贮藏30 d后的蓝莓为实验对象,模拟大多数超市货架温度4 ℃,运用电子鼻结合GC-MS技术分析进行蓝莓货架期间挥发性成分的变化,以期为蓝莓保鲜贮藏提供一些技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

蓝莓品种,莱克西 采自浙江宁波森田蓝莓采摘园；便携式塑料气调箱(规格:28 cm×22 cm×12 cm,内置2个篮筐,箱2个侧面分别有3个气调窗,其中左右气调窗为在长2 cm宽1.5 cm的长方形中开横4竖3的直径为1 mm的12个圆孔,中间为长2 cm宽1.5 cm的长方形气调窗,气调箱配套气调元件) 宁波国嘉农产品保鲜包装技术有限公司；1-MCP便携式包装 国家农产品保鲜工程技术研究中心(天津)提供。

3-30K离心机 德国SIGMA公司;恒温水浴锅 金坛市金南仪器制造有限公司;PEN3 型便携式电子鼻 德国Airsense公司;固相微萃取手柄和50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维头,美国Supleco公司;PC-420D数字型磁力加热搅拌装置 美国Corning公司;Trace DSQ MS气相色谱-质谱联用仪 美国Finnigan公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试材处理 采摘时选取大小一致、无机械损伤与病虫害的成熟果实,阶段预冷(3.5～4.5 ℃条件下预冷6～10 h,-1.6～-1.2 ℃温度下驯化6～8 h)后直接装入便携式塑料气调箱中做相应处理:a. 1-MCP:供试蓝莓果实装于便携式塑料气调箱内(2.4 kg/箱),放入1-MCP药品(空间1-MCP浓度1.0 μL/L),扣盖并粘贴封闭气调元件,处理24 h后,打开封闭气调元件;b. MAP:供试蓝莓果实装于便携式塑料气调箱内(2.4 kg/箱),扣盖并粘贴气调元件;c. 1-MCP+MAP:供试蓝莓果实装于便携式塑料气调箱内(2.4 kg/箱),放入1-MCP药品(空间1-MCP浓度1.0 μL/L),扣盖并粘贴气调元件;d. 对照(CK):供试蓝莓果实装于便携式塑料气调箱内(2.4 kg/箱),不粘贴气调元件。然后,通过顺丰冷链物流车运至实验室并放入冰温库((-0.5±0.3) ℃),预冷24 h后贮藏30 d。然后将四组处理蓝莓从冰温库取出,挑选完好成熟的蓝莓装入货架零售盒内置于4 ℃冰箱内。分别在贮藏的第0、3、6、9、12 d时取样,利用电子鼻和GC-MS测定蓝莓挥发性成分的变化。

1.2.2 电子鼻检测方法 PEN3便携式电子鼻由金属氧化物气体传感器阵列、气体采样装置和信号处理单元组成,传感器具有10个金属氧化物半导体型化学传感元件,如表1所示每种传感元件对应的敏感成分类型不同。取蓝莓35个于洁净干燥的600 mL烧杯中,用保鲜膜封口,在常温下封口平衡10 min后采用顶空吸气法进行数据采集。测定条件:传感器清洗时间70 s,自动调零时间10 s,样品准备时间5 s,样品测试时间50 s,样品测定间隔时间1 s,内部流量100 mL/min,进样流量100 mL/min。为了保证实验数据的稳定性和精确度,选取测定过程中第48～50 s的数据用于后续分析。为了消除漂移现象,更好地保证测量数据的稳定性和精确度,要求每次测量前后,传感器都要进行清洗和标准化。统计分析10个不同选择性传感器的G/G0值。每个处理重复测定6次。

表1 电子鼻传感器名称与其响应成分

1.2.3 HS-SPME-GC-MS测定方法 采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱/质谱分析(GC-MS)联用法测定,选用100 μm PDMS萃取头;气相色谱条件:HP-INNOWAX色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm);程序升温:40 ℃保留2 min,然后以2 ℃/min升至150 ℃保留1 min,再以5 ℃/min升至210 ℃保留5 min。传输线温度为250 ℃。载气为He,流速1 mL/min,不分流。质谱条件:连接杆温度280 ℃,电离方式为EI,离子源温度200 ℃,扫描范围35～350 amu。通过检索NIST/WILEY标准谱库,进行定性分析,用峰面积归一法测算各挥发性成分的相对含量。

1.3 数据处理

通过NIST/Wiley标准谱库检索,结合文献的标准谱图,进行定性分析,并用峰面积归一法测算各化学成分的相对含量。利用电子鼻Winmuster分析软件对采集到的数据进行分析,选取48～50 s区间内的平稳数值,采用负荷加载分析(loadings analysis,LA)及线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA)。图表采用Excel制作分析。

2 结果与分析

2.1 主成分分析货架期蓝莓挥发性成分

PCA是将数据降维并进行线性分类,得到主要的二维散点图,可从复杂的挥发性成分中筛选出关键综合分析因子[12]。在PCA分析中,对四种处理的电子鼻数据进行两两比较,其中第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的贡献率分别为84.644%和12.717%,86.367%和10.907%,90.356%和7.181%,累计贡献率分别为97.361%、97.274%、97.537%,其累计贡献率都大于95%,表明了2个主成分已经能基本代表了样本的主要信息特征,对于同一处理的蓝莓,货架期内蓝莓虽然有主成分在不同区域,且分界明显,但是仍有部分货架时间重叠交叉未能明显看出差异。可见,主成分分析方法并不能很好地区分不同货架时间的蓝莓。此外发现四种处理在货架3 d时第一主成分位移均处于一个较高数值而后下降,可见3 d是货架期蓝莓主要挥发性成分的变化拐点,而联合处理的蓝莓在9 d时达到第一主成分位移最大可推测联合处理对蓝莓主要挥发性成分的释放具有一定的抑制效果。

图1 不同处理的主成分分析

2.2 线性判别分析货架期蓝莓挥发性成分

线性判别分析(linear discrimination analysis LDA)是一种将原始数据投影到低维的方向,以所采集挥发性成分响应值的空间分布状态及彼此间的投影距离表现气味变化的速率,是判别函数分析的前提。与PCA(主成分分析)相比,LDA能够收集传感器所有信息并进行标准正常化转换,更好地解决分类问题,这在苹果、海棠果、杏鲍菇等果蔬中已广泛应用[13-15]。从图2中椭圆的分布位置来看,同一处理的不同货架时间可明显分开,可以看出货架过程中蓝莓挥发性成分差别明显,说明LDA能够很好地区分不同货架时间下蓝莓的挥发性成分,优于PCA分析。由图2A可知,MAP处理较CK组,除3 d时二者第一判别式未有良好的区分,在其余货架时间下均可有效地区分,以0和6 d最为明显(距离越大表明变化越快、越明显),说明MAP处理对蓝莓品质有较为明显的改变。

图2B中显示MAP与1-MCP在蓝莓货架期判别分析的结果,可以看出这两种不同处理在0、3、6 d有着明显的差异,说明这两种处理对蓝莓货架前期有着明显的改变。

图2C中可看出,MAP+1-MCP处理相较1-MCP单独处理,对蓝莓货架贮藏期间并未有明显改善,区域并未完全分离,可见对于挥发性的香气成分1-MCP与MAP+1-MCP相差不大,需要进一步借助GC-MS等仪器进行进一步分析。

图2 不同处理的LDA分析

2.3 载荷分析货架期蓝莓挥发性成分

载荷分析(loadings analysis):与PCA分析基于相同的算法,每个传感器贡献率系数在载荷图PCA坐标系上的位置可以体现其变量解释能力,即对特定气味的分辨力,位于靠近原点位置的传感器贡献率最低,在当前分析中的重要性最差,远离原点的传感器贡献率高[16]。

载荷分析的总贡献率分别为97.361%、97.274%、97.537%,达到97%以上,基本代表了样品的全部特征信息。利用电子鼻PEN3系统进行传感器载荷分析表明,贡献率最大的为传感器W5S,其次为W1S、W2S、W1W等,可见蓝莓挥发性成分中氮氧化物含量最高,这为之后的确定优化传感器阵列方法,使电子鼻可以用更少的传感器达到更好的分类效果,为电子鼻传感器阵列优化提供了新的思路和方法[17]。

图3 蓝莓挥发性成分的载荷分析

2.4 蓝莓货架期间GC-MS检测结果分析

从表2可知,用GC-MS共检测出76种挥发性成分,可分为8大类:醇(16种)、烷烃(11种)、醛(9种)、酮(1种)、酯(6种)、萜(14种)、杂环烃(3种)、其他(16种),CK、MAP、1-MCP、MAP+1-MCP中分别检测到45、41、38和43种化合物。实验中检测出的醛类主要为2-己烯醛(20.44%～82.42%)、己醛(0～12.91%);酮类主要为大马士酮(0～0.31%);醇类主要为反式-2-己烯-1-醇(0～22.71%);萜类成分主要为芳樟醇(0～11.43%)、香叶醇(0.2%～15.10%);杂环类成分主要是3,6-二氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃(0～0.55%);烃类成分主要是3,7-二甲基-1-辛烯(0～0.71%);酯类成分主要是异戊酸甲酯(0～0.44%);其他类成分主要是2,6-二叔丁基对甲酚(0～1.77%),这些物质均为该类分组内相对含量较高的物质,其中主要构成成分的结果与其他研究学者相似[18-19]。

表2 蓝莓货架期挥发性成分相对含量变化

续表

HS-SPME-GC-MS对样品的解析均在93%以上,检测数据可代表整个样品数据。其中醛类成分的相对含量变化较大,醛类(24.86%～91.98%)、醇类(0.24%～23.85%)、萜类(2.00%～43.00%),三者加和在货架所有天数内均大于71%,可见这三种物质为蓝莓内最主要的构成成分。在货架过程中,不同处理后货架期蓝莓的挥发性种类会不同程度减少,1-MCP组尤为明显,比CK组减少了7种化合物,但也有不同于其他处理组的化合物生成,如庚基氢过氧化物、5-异丙烯基-2-甲基环己醇等。实验中发现了几个特殊的物质,反式-2-己烯-1-醇这种物质在CK组和MAP组蓝莓货架9 d时相对含量分别为22.71%、20.48%,可以明显看出使用1-MCP处理可明显减少货架期间内醇类物质的相对含量,相较CK组和MAP组,使用1-MCP的处理组,反式-2-己烯-1-醇均位于实验仪器的检测线以下,推测与1-MCP这一化合物的添加有关。由图中还可以发现采用不同处理后可抑制货架期中4-二甲基-3-环己烯-1-乙醛这种成分的合成时期,CK组在货架3 d就能检测出0.11%的4-二甲基-3-环己烯-1-乙醛,而经过MAP或1-MCP处理后的蓝莓在货架9 d时才被检测出,而联合处理的蓝莓虽然在货架6 d时被检测到0.21%,但贮藏期内其相对含量远低于MAP或1-MCP组,推测这种成分与蓝莓衰老有着密切关系,且MAP与1-MCP联合处理对这种成分生成的抑制效果较好。实验中发现在MAP和1-MCP联合处理的12 d,其他类中庚基氢过氧化物这种物质被检出22.2%,推测其是蓝莓衰老腐败过程中醛类或者萜类的某种中间代谢产物。

此外,在挥发性成分中香叶醇具有类似玫瑰花的温和香甜气味,是一种重要的天然香精香料。芳樟醇主要是呈现浓青带甜的木青气息。在醛类中,2-己烯醛高浓度时具强烈的青草气味,低浓度时则呈新鲜水果的清香味,由于这些成分的存在蓝莓呈现出一种特殊风味[20]。在挥发型香气成分中芳樟醇(0～11.43%)、橙花醇(0～1.30%)、香叶醇(0.2%～15.10%)为同分异构体,为蓝莓货架期萜类中主要的挥发性成分[21]。且从相对含量上看,最主要的挥发性成分为2-己烯醛、芳樟醇、香叶醇。

2.5 不同处理对货架期蓝莓挥发性成分相对含量的影响

由图4可知,在蓝莓货架期过程中醛类物质是最主要的成分,在MAP处理的第3 d可高达91.98%。在货架0～9 d时蓝莓的醛类成分呈现出先升高后降低的趋势,3 d时达到顶峰,且CK与MAP处理的蓝莓下降趋势极其相似,并于9 d时达到最低值,相反,醇类物质和萜类物质呈现出先降低后升高的相反变化,推测在货架期间蓝莓内醛类、醇类、萜类这三种成分通过某种代谢过程相互转化,在成熟过程中先生成醛类成分而衰老过程生成醇、萜类成分[22]。在货架12 d,CK、MAP的醛类出现了大幅度回升,此时蓝莓处于即将腐烂的状态,推测此时细胞衰老死亡体内大量的成分流出导致挥发性成分大幅变化,且挥发性成分丧失[23],但是对于MAP+1-MCP联合处理的蓝莓,其在12 d时出现了醛类成分大幅下降的情况,与其他处理组9 d时变化相似,可见1-MCP结合MAP处理可抑制在货架后期醛类物质含量的减少,对于醛类这种物质的抑制,1-MCP也优于MAP、CK这两组处理,以货架9 d尤为明显,1-MCP组未呈现一个断崖式的下降[24],对于MAP与CK两组可以发现对于醛类的含量,在贮藏期内除12 d外均高于CK组,可见其对于醛类物质的保留效果较好。对于醛类这一含量最高的物质抑制流失的效果顺序为MAP+1-MCP>1-MCP>MAP>CK。

图4 不同前处理方法对蓝莓货架期果实挥发性成分的变化

3 讨论

1-MCP作为乙烯抑制剂的一种,在控制乙烯的成熟和成熟过程中起着重要的作用,乙烯的合成直接关乎蓝莓的贮藏品质[25],蓝莓冰温贮藏30 d后在4 ℃的环境下进行货架模拟,随着货架时间的延长果实内成分发生着明显的改变。应用电子鼻对蓝莓贮藏期间气味进行主成分分析、线性判别分析和载荷分析,发现LDA 分析相较PCA分析能有效地将不同货架时间的蓝莓区分开来,且蓝莓的气味变化明显,利用电子鼻无损检测不同蓝莓货架期是可行的。通过结合HS-SPME-GC-MS及电子鼻对蓝莓的测定,确定蓝莓在货架3 d后品质开始逐渐下降,表现3 d时醛类成分达到顶峰,随后醛类物质相对含量均低于3 d时,结合主成分分析结果,可以看出货架3 d是蓝莓品质变化的一个拐点。

利用HS-SPME-GC/MS对蓝莓贮藏期间的挥发性成分进行分析,共检测出76种挥发性成分。其中以醛类成分种类最多含量最高,是蓝莓的主要挥发性气味成分,且醛类成分含量的变化规律与PCA分析中变化趋势相近。但是由于1-MCP的添加和货架期蓝莓内进行着各种复杂代谢反应导致大部分挥发性成分(如芳樟醇、叶香醇、反式-2-己烯-1-醇等)的变化未有一个明显的变化规律。

敏感的传感器与HS-SPME-GC-MS分析所得的特征成分含量结果大致相符。实验中发现一些传感器在模式识别中负载参数近乎零,那么该传感器的识别能力可以忽略不计,在后续试验中可以尝试将那些传感器去除。

4 结论

针对PCA和LDA分析的图像可以观察到,3 d是货架期蓝莓主要挥发性成分的变化拐点,对于货架期的判别,判别分析法优于主成分分析法。传感器载荷分析表明,贡献率最大的为传感器W5S。HS-SPME-GC-MS所得结果中三大主要物质醛类(24.86%～91.98%)、醇类(0.24%～23.85%)、萜类(2.00%～43.00%)加和均大于71%,是蓝莓内主要的挥发性物质。特征挥发性成分为2-己烯醛、芳樟醇、香叶醇。对于电子鼻结合GC-MS分析结果的探讨,可见MAP+1-MCP联合处理对蓝莓延缓挥发性成分流失效果较好,对于醛类抑制流失的效果顺序为MAP+1-MCP>1-MCP>MAP>CK。