基于离子液体辅助提取的羊肚菌HPLC指纹图谱分析

沈千汇,黄 琦,李文佳,钱正明,3,*,张 霁,,*

(1.华南师范大学,脑科学与康复医学研究院,广东广州 510631;2.广东东阳光药业有限公司国家中医药管理局重点研究室,广东东莞 523850;3.湘南学院,湖南郴州423000)

羊肚菌为羊肚菌科羊肚菌(Morchella)的子实体,是世界著名珍稀食药用真菌,早在明代李时珍的《本草纲目》中就有记载,羊肚菌具有化痰利气、益肠胃、补脑提神等功效[1-2]。现代药学研究表明,羊肚菌含氨基酸、维生素、矿物质、多糖和脂肪酸等多类成分,具有抗氧化、抗肿瘤及保肝保肾等药理活性[3-5]。

目前羊肚菌化学质量评价研究主要在多糖方面,其他类成分研究较少[6-8]。中药材成分复杂,以某单一成分作为质量评价指标无法全面反映药材的质量。中药指纹图谱是一种综合有效的中药质量评价方法,其中最常用的为液相指纹图谱分析技术,其已广泛应用于冬虫夏草[9]、牛樟芝[10]、灵芝[11]等珍稀真菌类中药材的质量评价[12]。传统中药液相指纹图谱分析常用甲醇作为样品提取溶剂,采用甲醇-水或乙腈-水作为液相洗脱溶剂,因此在样品制备和分析过程中都会使用到大量有害有机溶剂[13-15]。如何减少有害有机溶剂在中药分析中的使用是现代分析方法研究的重要研究方向。Xu等[16]采用离子液体作为提取溶剂,提取青柠果实中黄酮苷类化合物,有效缩短了实验操作时间,同时减少了有机试剂的用量。付春梅等[17]采用乙醇代替甲醇、乙腈作为流动相,采用HPLC定量分析了黄芩、葛根等5种中药的有效成分,减少了有害溶剂使用。因此开发一种绿色的提取方法和液相分析方法对羊肚菌的质量评价提升具有重要的意义。

本实验在参考现有研究的基础上[16,18-19],采用离子液体-水溶液作为提取溶剂,采用乙醇-水作为液相洗脱溶剂,建立了一种绿色环保的高效液相色谱分析方法,并对珍稀食药用真菌羊肚菌进行了指纹图谱分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊肚菌 共20批,其中含14批六妹羊肚菌,6批不同食药用菌,所有实验样品经广东东阳光药业有限公司国家中医药管理局重点研究室钱正明高级工程师鉴定为指定品种,具体样品信息见表1;1-丁基-3-甲基咪唑氯盐([BMIM]Cl)、1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIM]Br)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM]BF4)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([OMIM]PF6) 纯度99%,上海成捷化学有限公司;对照品:胞苷(纯度99.00%,批号:#L1504068) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;尿嘧啶(纯度99.60%,批号:100469-201302) 中国食品药品检定研究院;尿苷(纯度98.00%,批号:6213) 上海诗丹德生物技术有限公司;鸟苷(纯度93.60%,批号:111977-201501) 中国食品药品检定研究院;腺苷(纯度99.40%,批号:WRS-18001) 武汉远成共创科技有限公司;乙醇 色谱纯,美国赛默飞世尔科技公司;乙酸 LC-MS级,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

表1 试验样品来源

1260型高效液相色谱仪、反相色谱柱Agilent ZORBAX SB-AQ C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm) 美国安捷伦科技有限公司;XS205型十万分之一电子天平 美国梅特勒-托利多仪器有限公司;5425型离心机 德国艾本德中国有限公司;Tube Mill 100 control研磨机 艾卡(广州)仪器设备有限公司;Milli-Q Advantage A10超纯水系统 德国默克密理博公司;2020型高通量组织研磨机 科瑞恩特北京科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液制备 依次精密称取尿嘧啶、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷对照品20.35、19.99、19.84、20.11、19.98 mg,置于20 mL容量瓶中,加超纯水溶解并定容至刻度线(20 mL),稀释50倍制成浓度分别为20.35、19.99、19.84、20.11、19.98 μg/mL的混合对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液制备 取供试品适量,经研磨机粉碎过三号筛制备成供试品粉末,取供试品粉末100 mg,精密称定,置2 mL离心管中,分别称入1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([OMIM]PF6)400 mg和超纯水600 mg,并将研磨珠置于该离心管中,湿法研磨提取10 min,离心(12000 r/min)5 min,取上清液,经100 ℃水浴5 min,再离心(12000 r/min)5 min,取上清液过0.45 μm水系滤膜,取续滤液,即得。

1.2.3 色谱条件 核苷类化合物极性大,在反相色谱中多采用高比例水流动相进行分析[18,20]。本实验采用耐纯水洗脱的Agilent ZORBAX SB-AQ C18反相色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)作为分离色谱柱,0.2%乙酸(A)-乙醇(B)流动相进行梯度洗脱(0～4 min,0% B;4～15 min,0～30% B);柱温40 ℃;流速1.0 mL/min;检测波长260 nm;进样量2 μL。

1.2.4 提取条件的优化 前期离子液体提取优化文献常用单因素考察的方法对离子液体提取过程中的关键因素进行优化,如离子液体类型、离子液体碳链长度、离子液体浓度、提取时间和料液比[16,18,21]。故本实验也采用单因素对上述5种提取参数进行了考察,同时采用外标一点法计算5种核苷成分总提取量,比较各参数对羊肚菌中化学成分提取效率的影响,每个样品做两次平行实验,提取量(Xi)通过公式(1)进行计算:

式(1)

式中:Xi代表提取量(μg/mg),Ai代表目标峰峰面积,Ar代表对照品峰面积,Cr代表对照品浓度(μg/mL),V代表样品体积(mL),m代表样品称样量(mg)。

1.2.4.1 离子液体离子类型考察 本实验选用脂溶性([BMIM]BF4、[BMIM]PF6)和水溶性([BMIM]Cl、[BMIM]Br)两类离子液体考察[18]。比较不同离子液体类型对提取量的影响,分别采用质量分数20%的[BMIM]Cl、[BMIM]Br、[BMIM]BF4、[BMIM]PF6溶液为提取溶剂,固定料液比1∶20 (mg/mg),其他条件按“1.2.2供试品溶液制备”项提取,随后按“1.2.3色谱条件”进行分析,比较各类型离子液体的提取效率。

1.2.4.2 离子液体碳链长度考察 考察离子液体不同碳链长度对提取量的影响,分别采用质量分数20%的[BMIM]PF6、[OMIM]PF6溶液为提取溶剂,固定料液比1∶20 (mg/mg),其他条件按“1.2.2供试品溶液制备”项提取,随后按“1.2.3色谱条件”进行比较分析。

1.2.4.3 不同质量分数离子液体考察 考察不同质量分数离子液体对提取量的影响,分别配制质量分数为10%、20%、30%、40%、50%的[OMIM]PF6溶液,固定料液比1∶20 (mg/mg),加入上述不同质量分数的离子液体,其他条件按“1.2.2供试品溶液制备”项提取,随后按“1.2.3色谱条件”进行分析,比较不同离子液体的质量分数对提取的影响。

1.2.4.4 提取时间考察 考察提取时间对提取量的影响,以质量分数为40%的[OMIM]PF6溶液为提取剂,料液比1∶20 (mg/mg),使用高通量组织研磨机湿法研磨分别提取5、10、15、20、25 min,其他条件按“1.2.2供试品溶液制备”项提取并按“1.2.3色谱条件”进行分析,考察提取时间对提取的影响。

1.2.4.5 料液比考察 考察料液比对提取量的影响,以质量分数为40%的[OMIM]PF6溶液为提取剂,采用高通量组织研磨机湿法研磨提取10 min,料液比分别为1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 (mg/mg),其他条件按“1.2.2供试品溶液制备”项提取,按“1.2.3色谱条件”进行比较分析。

1.2.5 方法学考察 指纹图谱分析方法通常会进行精密度、重复性和稳定性的方法学测试[22-23]。本研究的精密度试验:取混合对照品溶液,重复进样6针,记录各对照品峰面积。重复性试验:称取同一六妹羊肚菌样品6份进行色谱分析,记录6份样品中各共有峰峰面积。稳定性试验:称取六妹羊肚菌供试品溶液,4 ℃存放,在24 h内进样10次,记录各共有峰峰面积。

1.2.6 指纹图谱的建立 取20批试验样品按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液,并按“1.2.3”项下色谱条件分析,得到20批样品的液相色谱图。将其中14批六妹羊肚菌样品的色谱数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版),设S1为参照图谱,采用多点校正后进行自动匹配,标记10个共有峰,生成六妹羊肚菌对照指纹图谱(R),用对照指纹图谱(R)对14批六妹羊肚菌、6批食药用菌进行相似度评价。

1.3 数据处理

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)对样品色谱数据进行相似度评价,并计算各样品的相对峰面积,然后应用SPSS 22.0统计软件对试验样品色谱数据进行聚类分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

图1 离子液体离子类型考察

图2 离子液体的碳链长度考察

2.1.3 不同质量分数离子液体考察 确定提取溶剂为[OMIM]PF6,进一步比较离子液体-水溶液中所含的不同离子液体的量(质量分数为10%、20%、30%、40%、50%)对提取量的影响,结果如图3显示,总提取量随着溶剂中离子液体的量增加而增加,质量分数为40%时呈现峰值,继续升高质量分数，总提取量反而降低，可能因离子液体的粘度大,其扩散能力随着含量的增加而降低,羊肚菌中化学成分难以提出,故选择40%离子液体-水溶液用于实验样品分析。

图3 离子液体质量分数考察

2.1.4 提取时间考察 比较不同提取时间(5、10、15、20、25 min)对提取量的影响,结果如图4,研磨时间为10 min时提取量最大,随着提取时间的继续延长,提取成分可能被破坏,影响目标成分的检测,故选用研磨时间为10 min。

图4 提取时间的考察

2.1.5 料液比考察 以质量分数为40%的[OMIM]PF6溶液为提取剂,湿法研磨提取10 min,不同料液比(1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 (mg/mg))提取结果如图5所示,料液比为1∶10时提取量达峰值,已经提取完全,随后料液比逐渐增大时,可能受离子液体的粘度影响,提取量反而减少,故选取最适料液比为1∶10。

图5 料液比的考察

2.2 方法学考察

本实验从精密度、重复性、稳定性三方面对新建立的色谱分析方法进行了方法学确认。精密度试验各对照品色谱峰峰面积RSD%均在1%以内,表明仪器精密度良好。重复性试验各共有峰的峰面积的RSD%均小于4.0%,表明该方法重复性良好。稳定性试验各共有峰的峰面积的RSD%均在4.0%以内,表明样品溶液在24 h内稳定。

2.3 指纹图谱的建立

2.3.1 共有峰的指认 根据各样品HPLC色谱图确定了10个共有峰,通过与混合对照品溶液色谱图的比对(见图6),确认其中的1号色谱峰为胞苷,5号色谱峰为尿嘧啶,7号色谱峰为尿苷,9号色谱峰为鸟苷,10号峰为腺苷。

图6 混合对照品与羊肚菌样品HPLC色谱图

2.3.2 参照峰的选择 因10号峰出峰时间居中,峰面积适中,分离度好,在各样品中均稳定存在,故选取10号峰为参照峰S(见图6)。

2.3.3 指纹图谱相似度评价 使用生成的对照指纹图谱(R)对14批六妹羊肚菌、6批食药用菌进行相似度评价,分析结果见图7和表2。结果显示,14批六妹羊肚菌样品的相似度均在0.9以上,有6批食药用菌样品相似度在0.25～0.65之间。

表2 20批试验样品的相似度评价结果

图7 20批试验样品HPLC-DAD指纹图谱

2.4 聚类分析

采用SPSS 22.0统计软件中的组间连接法,以夹角余弦作为度量标准,以各样品10个共有峰的相对峰面积(表3)为变量进行聚类分析,结果见图8。20批试验样品可分为2大类,第一类为S1～S14号样品,均为六妹羊肚菌样品,样品间差异较小;第二类为S15～S20号样品,均为不同的食药用菌,与羊肚菌比较差异较大,说明实验建立的方法可有效区分羊肚菌与其他常见食药用菌。

表3 20批试验样品共有峰的相对峰面积

图8 20批试验样品的聚类分析结果

2.5 主成分分析

以各样品共有峰的相对峰面积(表3)为变量,采用SPSS 22.0统计软件进行主成分分析,结果见表4和图9。由表4可知,前3个成分累计方差贡献率达89.411%,表明这3个成分反映了原始变量的大部分信息,因此以其为主成分进行分析,结果见图9。由图9可知,20批样品可分为3类,第1类为S1～S14,均为羊肚菌,各样品间差异较小;第2类为S17和S20,其余样品归为第3类,第2、3类均为其他食药用菌,与羊肚菌样品比较差异较大,该结果与相似度评价、聚类分析结果基本一致,说明该实验方法可有效区分羊肚菌与其他常见食药用菌。

表4 主成分分析特征值以及贡献率

图9 20批试验样品主成分分析结果

3 讨论与结论

羊肚菌化学成分前期研究多以乙腈、甲醇作为流动相[29-31]。文献调研发现,乙醇-水作为流动相体系在合适的柱温和流动相比例条件下,分析结果同甲醇-水系统、乙腈-水系统的分析结果基本一致,差异不显著[17,31-34]。前期研究表明乙醇可替代甲醇、乙腈作为流动相达到绿色分析要求,故本实验选用绿色溶剂——乙醇作为流动相,比较了3种流动相体系(水-乙醇、0.1%甲酸-乙醇、0.2%乙酸-乙醇)对羊肚菌成分的分离效果,结果显示,0.2%乙酸-乙醇体系分离效果较好,色谱峰出峰较多,该体系在快速分析检测(分析时间<15 min)的同时,还减少了有机试剂对环境的污染。此外,在该实验色谱条件下比较了不同检测波长(220、260、280、350 nm)的分离效果,结果显示,检测波长为220、280和350 nm下时存在基线不稳定、色谱峰缺失等现象,检测波长为260 nm时,色谱峰分离较好且基线稳定,色谱峰出峰较多,故选择260 nm作为检测波长。

通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”对20批试验样品(含14批六妹羊肚菌、6批不同食药用菌)进行相似度评价,结果显示,与羊肚菌参照图谱(R)比较,14批羊肚菌样品相似度系数均大于0.9,其他样品相似度系数在0.25～0.65间,与羊肚菌样品存在明显差异,同高效液相分析结果基本一致。同时聚类分析和主成分分析结果显示,14批不同产地的羊肚菌样品差异较小,说明在不同的生长环境和储存条件中,其化学成分质量均一稳定;此外,各分析结果表明羊肚菌与其他食药用菌化学成分存在显著差异,说明建立的方法可用于羊肚菌与相似食药用菌的鉴别。

综上,本实验建立了一种快速、高效、绿色的羊肚菌高效液相指纹图谱分析方法,为羊肚菌及其相关产品综合质量评价的提升提供了技术支撑,为其深入化学研究和开发应用提供了数据参考。