三种食用菌提取物体外抗氧化与降血糖活性研究

罗丽平,李冰晶,赵景芳,杨 玲,*,李 威

(1.贵州省生物研究所,贵州贵阳 550009;2.贵州省贵福菌业发展有限公司,贵州贵阳 550009)

食用菌是一味传统的保健食材,在《吕氏春秋》、《本草纲目》中均有相关记载[1-2],长期食用食用菌,可补充身体中的所需营养,不仅利于预防疾病,还有利于健康长寿[3]。食用菌是指大型真菌中能形成具有胶质或肉质子实体或菌核组织并能食用或药用的菌类。世界能区分的约12万种已报道的有2000多种,我国报道的有981种,人工栽培的70余种,大规模生产的20 余种[4]。食用菌不仅肉质脆嫩、味道鲜美,且营养价值高。其中不仅含醇类、酯类、醛类、有机酸类等风味物质还含有丰富的氨基酸、核苷酸和糖水化合物[5]。近年来越来越多的研究表明食用菌具有抗氧化[6]、抗菌消炎[7]、降血糖(脂)[8]、增强机体免疫功抑制肿瘤生长等生物活性并得出食用菌多糖是一种非特异性免疫增强剂和免疫激活剂[9-10],部分食用真菌多糖已被广泛应用于医药、食品和保健品行业[11]。近年来随着脱贫攻坚农村产业革命的开展,贵州省把食用菌作为农村重点发展的产业之一,自此贵州省各食用菌种植面积呈逐年上升趋势并成效显著。本研究以茶树菇、松乳菇、竹荪和竹荪菌托为研究对象,主要是因为近年来贵州省的茶树菇和竹荪产业迅速发展,鲜菇产量高,但产业的过度发展会导致初级产品的过剩、滞销;其次松乳菇是贵州特色野生食用菌,开发价值极高;另外竹荪菌托是竹荪的副产物,采摘竹荪子实体后一般让其直接腐烂在地里,其中有效成分没有得到利用造成极大浪,如能对其进行很好的开发利用变废为宝,不仅可减少环境污染,还可通过高附加值产品的开发来提高食用菌的产值,从而延长产业链。且目前关于松乳菇、竹荪抗氧化和降血糖作用的研究报道甚少,虽对茶树菇抗氧化作用的研究有一定的报道,但其他活性还未被开发出来。实验对三种食用菌及副产物的提取物进行抗氧化和降血糖进行考察,旨在尽可能开发出食用菌的食、药两用价值，为食用菌高附加值产品的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜竹荪 由贵州省织金县“汇苑特色农业有限公司”提供;新鲜茶树菇 由“贵州省贵福菌业发展有限公司”提供;野生新鲜松乳菇 采摘于贵阳市花溪区高坡乡;二苯代苦味肼基自由基(DPPH·) 百灵威公司;α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷 上海伊卡生物技术有限公司;可溶性淀粉、二硝基水杨酸、PBS缓冲液、Na2CO3、抗坏血酸、H2O2、FeSO4、水杨酸 天津市致远化学试剂有限公司;铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、无水乙醇 均为分析纯,重庆川东化工有限公司;实验用水 均为二级水。

DZF-6021真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;EYELA N-3000循转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司;循环水式真空泵 郑州长城科工贸有限公司;DK-98-II水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;ISO9001型电子天平 北京赛多丽斯仪器系统有限公司;SB25-12DTD型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;LGJ-18型真空冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展公司;HP-845型紫外可见分光光度计 上海精科实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 将新鲜的竹荪子实体和竹荪菌托分离并用水洗去表面尘土后置于烘箱中50 ℃烘干、粉碎成粉末,同样将新鲜的茶树菇和松乳菇用水洗去表面尘土后置于烘箱中50 ℃烘干、粉碎成粉末。提取方法参照[12]并略做改进,称取适量的原料粉末,置于烧瓶中,向烧瓶中加入相当于原料8倍的蒸馏水,浸泡2 h后,80 ℃回流提取两次,每次2 h。合并提取液,减压浓缩后,用85%的乙醇对浓缩液进行醇沉处理,4 ℃静置过夜,去掉上清,50 ℃减压浓缩后于真空干燥箱中50 ℃真空干燥得到各提取物。称取各被试样品适量,将其用蒸馏水溶解并定容于容量瓶中配制成为5 mg/mL的样品溶液,将备试样稀释成所需浓度以备实验使用。由于样品本身溶解性和样品溶液本身颜色的影响,本实验测定的样品浓度范围为0.5～5 mg/mL，最大浓度为5 mg/mL,此浓度时样品溶解性相对较好,浓度继续增大无研究意义。

1.2.2 抗氧化活性测定

1.2.2.1 提取物对·OH清除率的测定 本研究采用水杨酸显色法[13]进行测定。反应体系由1 mL 8 mmol/L FeSO4,1 mL 8 mmol/L H2O2,1 mL 8 mmol/L水杨酸,1 mL蒸馏水,1 mL相应浓度的被试样品溶液。反应体系体积共计5 mL,将混合体系摇匀后置于37 ℃恒温水浴锅中加热反应30 min,后于510 nm处测定混合体系的吸光值(A1),用1 mL的蒸馏水代替反应体系中的水杨酸测得样品本底吸光值(A2),用1 mL的蒸馏水代替反应体系中的样品测得空白吸光值(A0)。以VC作为阳性对照,其测定方法相同。每组实验做三个平行,最终值取三次的平均值,清除率计算公式[14]见式(1)。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(1)

1.2.2.2 提取物对DPPH·清除能力测定 本研究参照[15-16]的检测方法。反应体系由1 mL不同浓度的被测样品溶液,1 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液和2 mL蒸馏水组成。将反应组合摇匀后置于25 ℃恒温水浴锅中避光加热反应15 min,后于517 nm处测定混合反应体系的吸光值(A1)。用1 mL的蒸馏水代替1 mL的DPPH·溶液其余成分相同,测得样品的本底吸光值(A2),用1 mL的蒸馏水代替1 mL的样品溶液其余成分相同,测得空白吸光值(A0)。以VC作为阳性对照。每组实验做三个平行,最终值取三次值的平均值,清除率计算公式见式(2)。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(2)

1.2.2.3 提取物对Fe3+总还原力测定 物质对Fe3+的还原能力也是常用的评价物质抗氧化能力的重要指标之一,实验一般采用铁氰化钾显色法[17]来对物质的还原能力进行测定。取各不同浓度被试样品1 mL,加入pH6.8的PBS缓冲液1 mL及1%的铁氰化钾溶液1 mL,摇匀后置于50 ℃恒温水浴锅中加热反应30 min。加热反应结束后取出并急速冷却后加入已配制好的10%的三氯乙酸溶液1 mL,充分混匀后4000 r/min离心10 min,取上清液1 mL并加入0.1%的三氯化铁溶液1 mL,随后加入3 mL的蒸馏水,混匀后于700 nm处测定此反应体系的吸光值(A1),以1 mL的蒸馏水代替不同浓度的试样品其他操作相同在700 nm处测得空白吸光值(A0)。以VC作阳性对照其他操作相同测定吸光值。以(A1-A0)的值来衡量提取物还原能力的强弱,还原力的强弱与吸光值的大小成正相关[18]。每组实验做三个平行,最终值取三次的平均值。

1.2.3 降血糖活性测定

1.2.3.1 提取物对α-淀粉酶活性抑制作用测定 本研究采用二硝基水杨酸(DNS)法[19]来测定被试样对α-淀粉酶活性的影响。向2 mL磷酸盐缓冲液(pH6.8)中加入0.5 mL 0.5%可溶性淀粉溶液和4 mL DNS作为空白调零,以1 mL缓冲液1 mL 1%α-淀粉酶溶液、0.5 mL 0.5%的淀粉和4 mL DNS 作为对照组测得A。取1 mL的被试样品溶液,再加入PBS定容至2 mL,再加入1 mLα-淀粉酶溶液,摇匀。放入37 ℃水浴预热10 min后,加入0.5 mL 0.5%的淀粉溶液,在37 ℃恒温水浴锅中反应10 min取出并加入4 mL DNS溶液,后置于沸水浴中5 min,待冷却后于540 nm下测得值A1。另取一组适量浓度的被试样品溶液作为本底组,加入缓冲液定容至3 mL,置于37 ℃水浴预热10 min后,加入0.5 mL PBS,37 ℃水浴10 min,加入4 mL PBS溶液,置于沸水中水浴 5 min,待冷却后于540 nm下测得吸光值A0。每组实验做三个平行,最终值取三次的平均值,抑制率计算[20]公式见式(3)。

抑制率(%)=[1-(A1-A0)/A]×100

式(3)

1.2.3.2 提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用测定 本研究采用4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)比色法[21-22]测定被试样品对α-葡萄糖苷酶活性的影响。以向4 mL磷酸盐缓冲液(pH6.8)中加入1 mL 0.1 mmol/L PNPG和1 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液作为空白调零组。以向3 mL缓冲液1 mL 20 mg/mLα-葡萄糖苷酶加入1 mL PNPG和1 mL Na2CO3溶液为对照组在400 nm处测得A。取被试样品溶液,加入缓冲液定容至3 mL,后加入1 mLα-葡萄糖苷酶溶液,摇匀后置于37 ℃水浴锅中加热反应10 min后加入1 mL PNPG继续37 ℃水浴反应10 min,取出并加入1 mL Na2CO3溶液,摇匀于400 nm测得吸光值A1。另取被试样品溶液加入缓冲液至4 mL,摇匀后于37 ℃水浴锅中加热10 min,随后加入1 mL PNPG,继续在37 ℃水浴中加热10 min后取出加入1 mL Na2CO3溶液,于400 nm下测得A0。每组实验做三个平行,最终值取三次的平均值,抑制率计算公式见式(4)。

抑制率(%)=[1-(A1-A0)/A]×100

式(4)

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0和Origin 8.0软件对实验数据进行显著性分析和作图,并计算半数抑制浓度IC50值。抗氧化实验各组均与阳性组进行比较,降血糖实验进行组间比较。各组实验均重复三次。

2 结果与分析

2.1 提取物对·OH的清除作用

由图1可看出,各提取物对·OH均有一定的清除能力,当提取物浓度达到5 mg/mL时，各提取物对·OH的清除能力大小依次为茶树菇提取物>VC>竹荪提取物>竹荪菌托提取物>松乳菇提取物。各提取物对·OH的清除能力与样品浓度呈一定的量效关系,在实验浓度范围内随着浓度的增加各提取物对·OH的清除能力也相应增强,其中茶树菇提取物组的增长幅度较大,竹荪提取物、竹荪菌托提取物、松乳菇提取物组的增长幅度较小。当实验浓度达到5 mg/mL时,茶树菇提取物的清除率(89.45%)与VC(87.86%)相当,其他各组均弱于VC,竹荪提取物和竹荪菌托提取物对自由基的清除能力相对较弱,清除率分别为45.61%和43.34%,松乳菇提取物对自由基的清除能力也较弱,清除率只有28.58%。

图1 食用菌提取物对·OH的清除作用

由表1可知,各提取物对·OH清除活性的IC50值大小依次为松乳菇提取物>竹荪提取物>竹荪菌托提取物>茶树菇提取物>VC。IC50值越小说明对自由基的清除能力越强。茶树菇提取物对·OH清除活性的IC50值与VC接近且在实验浓度范围内,其他各组均超出VC的5倍，不在有效浓度范围内,清除率相比VC较低,可认为竹荪、竹荪菌托、松乳菇提取物对·OH的清除能力均较弱,茶树菇提取物对·OH的清除能力较强。

表1 食用菌提取物对·OH的清除活性的IC50值

2.2 提取物对DPPH·的清除作用

由图2可看出,各提取物对DPPH·均有一定的清除作用，当提取物浓度达到5 mg/mL时，各提取物对DPPH·的清除率大小依次为VC>茶树菇提取物>松乳菇提取物>竹荪提取物>竹荪菌托提取物。当实验浓度在0.5～5 mg/mL时,各提取物表现出对DPPH·的清除能力与浓度呈一定的量效关系,除阳性组外茶树菇提取物组的增长幅度较其他各组大。当浓度达到5 mg/mL时,茶树菇提取物对DPPH·的清除率(87.81%)与VC(89.21%)相当。其他各组均弱于VC组。竹荪和竹荪菌托的提取物对DPPH·的清除能力均较弱,清除率为35.80%和34.35%，均达不到VC的一半。松乳菇提取物对DPPH·清除率为53.08%。

图2 食用菌提取物对DPPH·的清除作用

由表2可知,各提取物对DPPH·清除活性的IC50值大小依次为竹荪菌托提取物>竹荪提取物>松乳菇提取物>茶树菇提取物>VC。IC50值越小说明清除能力越强,除茶树菇提取物和松乳菇提取物对DPPH·清除活性的IC50值均在实验浓度范围内,松乳菇提取物的IC50值虽在有效浓度范围内,但很接近最大浓度,因此意义不大,可认为竹荪、竹荪菌托、松乳菇提取物对DPPH·的清除能力均较弱,茶树菇提取物对DPPH·的清除能力较强。

表2 食用菌提取物对DPPH·清除活性的IC50值

2.3 提取物对Fe3+的还原作用

由图3可以看出,各提取物对Fe3+具有不同程度的还原能力，当样品浓度达到5 mg/mL时，各提取物对Fe3+的还原作用强弱依次为茶树菇提取物>VC>竹荪菌托提取物>竹荪提取物>松乳菇提取物。在实验浓度范围内各提取物对Fe3+均表现出不同程度的还原能力且与浓度呈正相关。当浓度达到5 mg/mL时茶树菇提取物对Fe3+的还原能力强于VC,松乳菇对Fe3+的还原能力较弱,竹荪和竹荪菌托提取物对Fe3+的还原能力相近但均弱于茶树菇提取物和VC。

图3 食用菌提取物对Fe3+的还原作用

由表3可知,各提取物对Fe3+还原能力的IC50值大小依次为松乳菇提取物>竹荪提取物>竹荪菌托提取物>茶树菇提取物>VC。IC50值越小说明还原能力越强。茶树菇提取物的IC50值在实验浓度范围内,还原能力与VC相当其他,而其他各组均是VC的5倍左右,还原能力对于VC来说及弱,可认为竹荪、竹荪菌托、松乳菇的提取物对Fe3+的还原能力均较弱,茶树菇提取物对Fe3+的还原能力较强。

表3 食用菌提取物对Fe3+还原能力的IC50值

2.4 提取物对α-淀粉酶活性抑制作用

由图4看出,各提取物对α-淀粉酶均有一定程度的抑制作用，样品浓度达到5 mg/mL时，各提取物对α-淀粉酶活性抑制率大小依次为松乳菇提取物>茶树菇提取物>竹荪菌托提取物>竹荪提取物。且各提取物对α-淀粉酶的活性均有不同程度的抑制作用,各提取物对α-淀粉酶的抑制作用与质量浓度呈一定的量效关系,抑制率随浓度的增加均有不同程度的增加,其中松乳菇提取物组和茶树菇提取物组的增长幅度最大,当浓度达到5 mg/mL时,松乳菇和茶树菇提取物对α-淀粉酶活性的抑制率分别为83.52%和62.15%,而竹荪和竹荪菌托提取物对α-淀粉酶活性的抑制作用相对较弱只有14.15%和24.2%。

图4 食用菌提取物对α-淀粉酶活性抑制作用

由表4可知,各提取物对α-淀粉酶活性抑制的IC50值大小依次为竹荪提取物>竹荪菌托提取物>茶树菇提取物>松乳菇提取物。IC50值越小则表明抑制作用越强,茶树菇和松乳菇提取物的IC50值在实验浓度范围内,而竹荪及副产物的提取物在实验浓度范围内的抑制率均小于50%,说明二者对α-淀粉酶活性抑制作用均较弱,茶树菇和松乳菇提取物对α-淀粉酶活性抑制作用较强。

表4 食用菌提取物对α-淀粉酶活性抑制的IC50值

2.5 提取物对 α-葡萄糖苷酶活性抑制作用

由图5看出,各提取物对α-葡萄糖苷酶的活性均有不同程度的抑制作用,当浓度达到5 mg/mL时，各提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制率大小依次为松乳菇提取物>茶树菇提取物>竹荪菌托提取物>竹荪提取物。且各提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率与质量浓度呈现一定的量效关系,随着各被试样浓度的增加，抑制能力也在不同程度的增加,其中野生松乳菇提取物组和茶树菇提取物的增加幅度相对较大,当浓度达到5 mg/mL时,松乳菇提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为75.43%,茶树菇提取物对该酶的抑制率为57.08%,而竹荪和竹荪菌托提取物的抑制率只有22.32%和20.63%。

图5 食用菌提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用

由表5可知,各提取物对α-淀粉酶活性抑制的IC50值大小依次为竹荪提取物>竹荪菌托提取物>茶树菇提取物>松乳菇提取物。IC50值的大小亦可表示抑制率的高低,IC50值越小说明抑制作用越强,茶树菇和松乳菇提取物的IC50值在实验浓度范围内,竹荪及副产物提取物在实验浓度范围内的抑制率均小于50%,说明二者对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用均较弱,茶树菇和松乳菇提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用较强。

表5 食用菌提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制的IC50值

3 讨论与结论

自由基学说认为生命体会衰老是因为体内物质代谢产生的自由基容易与细胞内的脂质、蛋白质、DNA等组成物质发生反应[23],使得这些物质的结构和功能发生改变,最终导致机体衰老[24]。糖尿病是由遗传、饮食、环境等因素导致的胰岛素功能的衰减[25],从而导致胰岛素敏感性低,影响相关代谢酶的活性[26],其中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶就是影响人体血糖水平最主要的两种酶。α-葡萄糖苷酶能催化水解人体摄取的碳水化合物中的α-1,4-糖苷键,并释放葡萄糖,促进了小肠对糖的吸收,使得血糖浓度升高[27]。而α-淀粉酶可水解淀粉内部的α-1,4-糖苷键并产生糊精、低聚糖和葡萄糖等物质。α-淀粉酶同样会造成血液中血糖浓度升高[28]。因此,清除机体内的自由基和抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性能够有效地延缓机体的衰老和降低机体的血糖水平,以达到延缓衰老和降血糖的目的,从而预防相应病并发症。

本研究采用不同的反应体系对三种食用菌及副产物的提取物的体外抗氧化和降血糖活性进行了评价,实验分别测定各提取物对·OH、DPPH·的清除能力和对Fe3+的还原能力以及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用来考察三种食用菌及副产物提取物的抗氧化和降血糖活性。在实验浓度范围内三种食用菌及副产物的提取物均表现出不同程度的抗氧化和降血糖活性,且呈现明显的量效关系,当浓度达到5 mg/mL时,茶树菇提取物对·OH和DPPH·的清除率最高可达89.45%和87.81%,对Fe3+的还原能力与VC相近,IC50均为1.04 mg/mL;而竹荪和竹荪菌托提取物对·OH(45.19%和36.04%)、DPPH·(44.30%和36.81%)的清除率和对Fe3+的还原能力(46.61%和48.09%)均较低,且IC50值均超出实验浓度。当浓度达到5 mg/mL时,茶树菇提取物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率分别62.15%和57.08%,IC50值为3.82和4.10 mg/mL;松乳菇提取物对两种酶的抑制率分别为83.52%和75.43%,IC50值为2.22和2.53 mg/mL;;而竹荪和竹荪菌托提取物对α-淀粉酶(15.15%和24.56%)和α-葡萄糖苷酶(26.20%和23.41%)的活性抑制率较低,且IC50值均超出实验浓度。实验结果得出,茶树菇提取物的降血糖作用和抗氧化作用均较强,松乳菇提取物的降血糖作用较强抗氧化作用较弱,而竹荪和竹荪菌托提取物的抗氧化活性和降血糖活性均较弱,具体药物作用机制有待进一步研究。竹荪及副产物提取物的其他生物活性还有待进一步考察。