益生菌发酵蓝莓花色苷的代谢规律

陶 阳,廖小军,韩永斌

(1.中国农业大学食品科技与营养工程学院,北京 100083;2.南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

益生菌是可定植于人体生殖系统或肠道,能产生明确健康功效、改善宿主微生态平衡和发挥有益作用的活性微生物[1]。通常消费者摄入的每克产品中益生菌活菌数需超过107CFU[2]。此外,益生菌还能在人类胃肠道的条件下存活[1-2]。目前,主要从人类、动物的粪便和发酵食品中分离益生菌[3]。虽然益生菌在市场上主要以发酵乳制品的形式出售,但乳制品中存在致敏原,导致部分消费者无法放心食用,因此,近年来越来越多的研究者开展了益生菌发酵非乳制品的相关研究[4]。果蔬汁含有微生物生长所需的维生素、矿物质、蛋白质、糖等营养素,因而被认为是开发非乳制品益生菌饮料的理想基质[5-6]。Xin等[7]研究了超高静压水处理的荔枝汁经干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)发酵后制得的益生菌饮料的稳定性,研究表明,此款益生菌饮料具有良好的色泽、风味和接受度,且具有较高的总酚含量和抗氧化能力,在 4 ℃下可贮藏4周。Pimentel等[8]通过添加低聚果糖和副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)对苹果汁进行发酵,发酵苹果汁的可接受度与纯苹果汁相似,但具有更高的酸度和浑浊度。Maryati 等[9]利用保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)和两岐双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)发酵西兰花汁,结果表明,不同益生菌发酵西兰花汁后其抗氧化活性、总酚含量和pH存在显著差异(P<0.05)。

酚类物质广泛分布于各种果蔬中,是重要的功能性和风味物质。益生菌发酵果蔬的过程中,微生物的代谢活动可产生酚酸脱羧酶、还原酶等酶,将酚酸转化为一系列衍生物,对发酵果蔬制品的营养和风味产生深远影响[10-11]。例如,植物乳杆菌可以将p-香豆酸、没食子酸、阿魏酸、咖啡酸等酚酸转化成重要的风味物质,如 4-乙烯基苯酚、4-乙烯基愈创木酚等,以及强抗氧化物质,如焦棓酸、二氢咖啡酸等,从而提高了发酵果蔬制品的风味特征和营养功能[12-14]。此外,益生菌发酵使酚酸类物质发生脱羧和还原,进而提高酚酸在人体内的消化和吸收率[15]。此外,Markkinen等[16]选用植物乳杆菌对桑葚汁进行发酵,植物乳杆菌发酵36 h后,复杂的结合酚转化为游离酚,并通过多酚氧化酶使高分子量酚类化合物解聚,从而增加了DPPH自由基清除能力(增加 14.47%)。曹雪丹等[17]选用副干酪乳杆菌发酵瓯柑汁10 d,瓯柑汁内总酚含量显著升高(P<0.05)。Zhong等[18]采用植物乳杆菌发酵苹果汁,发现具有强抗氧化能力的槲皮素和5-O-咖啡酰奎尼酸等酚类成分含量有所升高,因此发酵后DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均有显著提高。综上,采用益生菌发酵生物转化酚酸类物质是增进果蔬制品品质和功能的重要手段,但目前益生菌发酵对花色苷类酚类物质的代谢规律影响和作用机理尚不明确。

因此,本研究选取嗜热链球菌、两岐双歧杆菌、植物乳杆菌三种益生菌,将蓝莓花色苷提取物添加到培养液中,研究发酵过程中微生物的发酵特性以及花色苷的衍变,以期为益生菌发酵富含花色苷类果蔬制品的研究和开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓(品种为“兔眼”) 江苏省伊云贝尔有限公司;嗜热链球菌CGMCC 1.8748、两岐双歧杆菌CGMCC 1.5090、植物乳杆菌BNCC 337796 中国微生物菌种保藏中心(北京);MRS肉汤培养基、PYG液体培养基、MRS琼脂培养基、BBL琼脂培养基 上海盛思生化科技有限公司。

MJ-BL25B2榨汁机 美的集团股份有限公司;XOWX-100真空冷冻干燥机 南京先欧仪器制造有限公司;RE-52旋转蒸发仪 上海研承仪器有限公司;JA1003电子天平 上海浦春计量仪器有限公司;LDZF-50KB立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;HH-4数显恒温水浴锅 国华电气有限公司;SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱、YQX-II厌氧培养箱 上海跃进医疗器械有限公司;M1-16K台式高速离心机 湖南可成仪器设备有限公司;LC-2010A液相色谱仪 日本岛津公司;UV 5100B紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓渣花色苷提取液的制备 蓝莓打浆后过滤收集蓝莓渣,然后参考Khazaei等[19]方法提取花色苷,并稍加修改。在25 ℃室温下,将蓝莓渣和50%乙醇水溶液按料液比1∶15 g/mL混合,随后于25 ℃、120 r/min条件下水浴振荡浸提24 h,8000 r/min离心20 min后取上清液,40 ℃旋转蒸发去除乙醇,制得花色苷粗提液,再用XAD-7HP大孔树脂纯化后,真空冷冻干燥48 h得蓝莓花色苷粉末(冷冻干燥参数为:压力0.0045 MPa、冷阱温度(57 ℃)。

1.2.2 菌种预处理 菌种的活化参考Jeong等[20]的方法,并加以修改。用无菌吸管吸取300 μL液体培养基(植物乳杆菌和嗜热链球菌采用MRS肉汤培养基;两岐双歧杆菌采用PYG液体培养基),滴入安瓿管内,轻轻振荡,使冻干菌粉呈悬浮状态。吸取全部菌悬液,将其移入相应的液体培养基中,37 ℃恒温静置培养24 h。经将活化后的菌液按1∶1 (V∶V)保存于50%甘油管中。

1.2.3 益生菌发酵 参考Oh等[21]的方法,并稍作修改。将配置好的液体培养基于121 ℃高温灭菌20 min。将纯化后的花色苷冻干粉复溶于无菌水中,使总花色苷浓度为2.5 g/L,然后在超净台内采用无菌滤膜过滤除菌。移取2 mL的花色苷溶液加入到培养液中,使花色苷总浓度达到100 mg/L,其后按2%的接种量分别接种活化后的嗜热链球菌、两岐双歧杆菌和植物乳杆菌,使初始活菌数达到约7 lg CFU/mL。含两岐双歧杆菌的发酵液置于厌氧培养箱中,进行严格的厌氧发酵,其余样品置于恒温培养箱中,37 ℃静置发酵48 h,于发酵0、6、12、24、36、48 h后收集样品进行理化及微生物指标分析。

1.2.4 测定指标与方法

1.2.4.1 菌落总数 采用平板计数法测定发酵过程中三种益生菌的菌落总数[22]。其中MRS琼脂培养基用于计数嗜热链球菌和植物乳杆菌,BBL琼脂培养基用于计数两岐双歧杆菌。

1.2.4.2 体外抗氧化能力 ABTS+·清除能力:参考He等[23]的研究。将2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS)与过硫酸钾分别用蒸馏水溶解后再混合,制成储备液(终浓度为7、2.45 mmol/L),25 ℃下避光静置16 h。测定时,储备液用0.2 mol/L,pH为7.4的磷酸盐缓冲液稀释至734 nm处吸光值为0.70±0.02,将其作为测定液。取0.2 mL待测样液与3.8 mL 测定液混合,30 ℃避光水浴静置6 min后测定734 nm处的吸光值,根据ABTS+·抑制率,计算样品的Trolox当量(mmol Trolox/L)。

FRAP测定方法:参考He等[23]方法。以40 mmol/L的HCl溶液为溶剂,配制10 mmol/L的2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ)溶液,用蒸馏水配制20 mmol/L的FeCl3溶液和0.3 mol/L、pH3.6的CH3COONa缓冲液,三者按体积比1∶1∶10混合,使用前于37 ℃避光水浴1 h,配制成TPTZ工作液。测定时取0.1 mL样品、0.3 mL去离子水、3 mL TPTZ工作液于37 ℃水浴避光反应6 min,测定593 nm处吸光值(mmol Fe2+/L)。

1.2.4.3 单体花色苷含量 单体花色苷含量的测定参考Cui等[24]方法,并稍加修改。样品在13000 r/min、4 ℃离心10 min后过0.22 μm滤膜,进行HPLC分析。HPLC测定参数如下:

色谱柱型号:安捷伦 TC-C18柱(4.6×25 mm,5 μm);流动相:A相为0.5%的三氟乙酸水溶液,B相为乙腈。梯度洗脱程序参数如下:0～5 min,10%～12% B;5～14 min,12%～13% B;14～16 min,13%～14% B;16～18 min,14%～16% B;18～19 min,16%～18% B;19～22 min,18%～22% B;22～35 min,22%～30% B;35～45 min,10%B。柱温:30 ℃;检测波长:520 nm;流速:0.8 mL/min,进样量:10 μL。

1.2.4.4 酚酸含量 酚酸含量测定按照Zhu等[25]方法,并稍加修改。HPLC参数如下:

色谱柱:InertsilODS-3(4.6×250 mm,5 μm);柱温:25 ℃,测定波长为280 nm,进样量:20 μL。流动相:A液:含1%醋酸的水溶液,B液:含1%醋酸的甲醇溶液,流速:0.6 mL/min,梯度程序按如下方式设定:0～10 min,10%～26% B;10～25 min,26%～40% B;25～45 min,40%～65% B;45～55 min,65%～95% B;55～58 min,95%～10% B;58～65 min,10% B。

1.2.4.5 有机酸含量 参考Lima等[26]方法,并稍加修改。HPLC方法如下:

色谱柱:安捷伦TC-C18柱(4.6×250 mm,5 μm);柱温:30 ℃,测定波长为210 nm,进样量:20 μL。流动相:pH2.9的0.08 mol/L KH2PO4溶液进行等梯度洗脱,流速:0.7 mL/min。

1.3 数据处理

实验设三次重复,试验结果采用SAS 9.4做显著性分析,显著性检验用LSD在P=0.05水平上进行,Minitab 18统计软件做主成分分析。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中三种益生菌菌落总数变化

作为发酵过程中衡量各种微生物在体系中生长情况的重要指标,菌落总数可直观反映出三种益生菌在含有花色苷的培养液中生长代谢情况。嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus,ST)、两岐双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum,SQ)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum,LP)在添加蓝莓花色苷的培养液中菌落总数变化如图1所示。嗜热链球菌、两岐双歧杆菌和植物乳杆菌初始浓度约为7.0 lg CFU/mL,三种益生菌数量均在发酵前12 h快速增加,随后趋于稳定。37 ℃发酵48 h后,添加蓝莓花色苷的培养液中两岐双歧杆菌菌落总数最高,为8.19±0.10 lg CFU/mL,其次为嗜热链球菌(8.02±0.11 lg CFU/mL)和植物乳杆菌(7.94±0.09 lg CFU/mL)。其中,发酵48 h后仅两岐双歧杆菌菌落总数和植物乳杆菌的菌落总数之间存在显著性差异(P<0.05)。Li等[27]测定了蓝莓花色苷提取物在体外模拟结肠发酵下对人体肠道菌群微生物的影响,结果表明其能促进双歧杆菌的生长。因此,虽然三种益生菌都能在添加花色苷的培养液中较好的生长,但两岐双歧杆菌可能是更适于蓝莓渣花色苷培养基体系的益生菌种。

2.2 益生菌发酵前后发酵液体外抗氧化能力变化

浆果中抗氧化活性物质主要为花色苷和其他酚类物质[28]。通过测定含花色苷的培养液在发酵前后抗氧化能力的变化,可以反映出三种益生菌发酵过程对蓝莓花色苷和其他酚类物质生物活性的影响。在抗氧化能力体外测定方法中,选择ABTS法测定发酵液的 ABTS+·清除能力,选择FRAP法测定发酵液对Fe3+的还原能力。

由从图2可知,发酵前含蓝莓花色苷的ST、SQ和LP培养液中ABTS+·清除能力分别为(61.91±6.83)、(63.11±6.19)、(63.23±6.02) mmol Trolox/L,Fe3+还原能力分别为(8.62±0.92)、(9.15±0.86)、(8.87±0.79) mmol Fe2+/L,三者之间无显著性差异(P>0.05)。经三种益生菌发酵48 h后,各组发酵液ABTS+·清除能力均显著提高(P<0.05)。其中两岐双歧杆菌发酵后增幅最大,为(49.06±2.26) mmol Trolox/L,其次为植物乳杆菌发酵(38.22±1.18 mmol Trolox/L)和嗜热链球菌(29.74±9.16 mmol Trolox/L)发酵(P<0.05)。Li等[29]用植物乳杆菌发酵富含酚类物质的苹果汁,发现其DPPH和ABTS+·清除能力在发酵后也显著性提高(P<0.05)。Kwaw等[30]选用不同的乳杆菌发酵桑葚汁也发现了同样的现象。这可能是因为在益生菌发酵过程中出现了酚类物质的生物转化,将部分酚类成分转化成了抗氧化能力更高的衍生物[31]。Alicia等[32]就指出一些微生物如芽孢杆菌可以将阿魏酸或对香豆酸转化为香兰素或4-乙烯基愈创木酚。一方面,益生菌发酵提高植物组分抗氧化活性的过程也受到pH、温度、发酵时间、微生物种类等多种条件的影响[33],因此,三种益生菌发酵的培养液抗氧化能力差异可能源于微生物自身代谢酚类物质的方式和机制不同[34];另一方面,两岐双歧杆菌发酵后的培养液Fe3+还原能力显著提高(P<0.05),植物乳杆菌和嗜热链球菌发酵前后均无显著差异(P>0.05)。这可能是由于不同测定方法考察的能力有所不同,ABTS法主要是考察样品中的成分对自由基的清除能力,而FRAP法主要考察样品中组分的还原能力[35]。因此,益生菌发酵可能只提升了含蓝莓花色苷培养液的自由基清除能力。

图2 不同益生菌发酵前后发酵液体外抗氧化能力变化

2.3 益生菌发酵过程中有机酸的变化

益生菌发酵含蓝莓花色苷培养液过程中有机酸含量变化如图3所示。发酵过程中鉴定到的有机酸主要为乳酸和丙酮酸。其中,乳酸的含量先上升后趋于稳定,丙酮酸含量呈先上升后下降的趋势。发酵48 h后,植物乳杆菌发酵的培养液中乳酸含量最高(2007.77±350.18 mg/L),其次是嗜热链球菌(1546.83±348.18 mg/L)和两岐双歧杆菌(914.89±116.18 mg/L)发酵的样品。两岐双歧杆菌产乳酸的能力弱于植物乳杆菌和嗜热链球菌,这可能与三株益生菌自身代谢差异有关,植物乳杆菌和嗜热链球菌的主要发酵途径为利用发酵体系中的碳源和氮源进行同型乳酸发酵,其发酵的产物主要为乳酸,而两岐双歧杆菌则主要进行异性乳酸发酵,其发酵产物除乳酸外,还有乙醇和乙酸等[36]。

图3 不同益生菌发酵过程中有机酸含量变化

2.4 益生菌发酵过程中单体花色苷的变化

主成分分析可将多变量的数据进行降维处理,提取其中主要的特征进行线性分析。因此为了进一步阐明嗜热链球菌、两岐双歧杆菌、植物乳杆菌在含蓝莓花色苷培养液体系发酵过程中单体花色苷种类以及其含量的变化情况,采用主成分分析法(PCA)对发酵48 h内不同样品进行分析,分析结果如图4所示。其中第一分量(PC1)和第二分量(PC2)累计解释数据差异的91.8%,可以综合六项指标的大部分信息。另外,表2为不同发酵阶段发酵液中花色苷的含量。

表2 益生菌发酵过程中培养液中花色苷含量变化

图4 益生菌发酵培养液中单体花色苷的主成分分析图(A)和载荷图(B)

由图4A可知,添加蓝莓花色苷的发酵样品在PC1上的分值随发酵时间的增长而逐渐降低,表明益生菌发酵可显著改变培养液中花色苷的组成。其中未发酵样品和发酵12 h内的植物乳杆菌和嗜热链球菌样品分布于PC1的正向区间内,而发酵24 h后的样品则主要分布于PC1的负向区间内。单体花色苷的载荷图中包括六种单体花色苷——飞燕草-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵素-3-葡萄糖苷、锦葵素-3-半乳糖苷和锦葵素-3-阿拉伯苷,均分布在PC1的正区间,因此可以判断发酵过程中六种单体花色苷的含量均有不同程度的下降,表明所选择的三株益生菌均能不同程度的代谢蓝莓花色苷。以植物乳杆菌的发酵样品为例,发酵48 h后飞燕草-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵素-3-葡萄糖苷、锦葵素-3-半乳糖苷和锦葵素-3-阿拉伯苷的含量分别下降了(71.24±5.30)、(11.41±2.05)、(15.30±2.29)、(7.89±0.57)、(11.57±1.37)和(18.19±3.14) mg/L。此外,从图4还可看出随着发酵时间的延长,不同发酵样品朝PC1负区间移动的幅度下降,表明发酵后期单体花色苷的下降幅度有所降低,这可能是由于三株益生菌在发酵过程中将花色苷转化为小分子的酚酸并产生了有机酸[33],降低了培养基中的pH,从而减缓了花色苷的降解。

从图4A还可以看出,不同益生菌株发酵的样品在单体花色苷组分方面存在一定差异。两岐双歧杆菌发酵的样品主要存在于PC2的负向区间,而植物乳杆菌和嗜热链球菌发酵的样品主要存在于PC2的正向区间。结合图4B可发现三株益生菌对花色苷的代谢差异主要来自于锦葵素-3-半乳糖苷和锦葵素-3-葡萄糖苷含量的差异。植物乳杆菌、嗜热链球菌和两岐双歧杆菌在发酵48 h后锦葵素-3-半乳糖苷分别降解了(11.57±1.37)、(10.44±2.24)和(10.90±0.83) mg/L,锦葵素-3-葡萄糖苷分别下降了(7.89±0.57)、(10.13±1.17)和(5.04±0.59) mg/L。Otieno等[37]指出益生菌所具有的α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶在异黄酮糖苷的水解中至关重要,但不同菌株水解糖苷的能力有所差异,这可能是导致三株益生菌对花色苷的代谢能力有差异的原因。

2.5 益生菌发酵过程中酚酸的变化

酚酸的组成和含量也是反映花色苷体系代谢的重要指标,因为益生菌等微生物可以将部分花色苷B环C3的糖苷键脱甲基化,从而形成小分子的酚酸[38]。三株益生菌发酵含蓝莓花色苷培养基过程中酚类物质含量变化的主成分分析如图5所示。同时,发酵不同阶段酚酸含量见表3。主成分的第一分量和第二分量可累计解释数据差异的74.2%。由图5A可知,三株益生菌发酵的样品PC1值均随着发酵时间的延长而逐渐减少。发酵前,样品主要分布于PC1的正向区间内,发酵48 h后三株发酵样品均分布于PC1的负向区间内,表明培养液中酚酸组成发生了显著变化。而载荷图中仅有绿原酸、对香豆酸和咖啡酸位于PC1的正向区间内,没食子酸、丁香酸和阿魏酸均分布于PC1的负向区间,这表明随着发酵时间的延长,三株益生菌发酵样中绿原酸、对香豆酸和咖啡酸的含量总体呈现下降趋势,而没食子酸、丁香酸和阿魏酸含量总体呈现上升趋势。此外,同一发酵时间内,三株益生菌发酵的样品分布差异较大,两岐双歧杆菌的发酵样主要分布于PC2的正向区间内,而嗜热链球菌的发酵样则主要分布于PC2的负向区间内,结合载荷图可知这种差距主要来自于没食子酸、阿魏酸和咖啡酸含量的差异。例如,在发酵第48 h时,两岐双歧杆菌发酵样中没食子酸和阿魏酸的含量比发酵前上升了(8.74±2.99)和(1.75±0.22) mg/L,咖啡酸比发酵前下降了(0.71±0.12) mg/L,但在嗜热链球菌的发酵样中没食子酸和阿魏酸的含量仅比发酵前上升了(5.79±5.08)和(1.66±0.34) mg/L,咖啡酸下降了(0.15±0.18) mg/L。其中,阿魏酸可以通过矢车菊-3-葡萄糖苷中B/C环的断裂形成,而没食子酸和丁香酸等酚酸主要为锦葵素类花色苷的降解产物[39]。此外,乳酸菌还可以将绿原酸分解为咖啡酸,并被酚酸脱羧酶和还原酶进一步代谢为二氢咖啡酸、乙基儿茶酚和乙烯基儿茶酚等衍生物[40-41]。随着发酵时间的延长,分值图中不同菌株发酵样朝PC1负方向移动的幅度变缓,这可能是由于益生菌中负责花色苷降解的酶需要由花色苷诱导,而发酵后期样品中花色苷的浓度较低,降解花色苷的酶活力较弱,因而酚酸的变化趋于缓慢[42]。通过以上花色苷和酚酸的代谢规律,可为进一步研究益生菌发酵果蔬体系功能性物质的衍变提供理论依据。

表3 益生菌发酵过程中培养液中酚酸含量变化

图5 益生菌发酵培养液中酚酸的主成分分析图(A)和载荷图(B)

3 结论

本研究选用植物乳杆菌、嗜热链球菌和两岐双歧杆菌对添加蓝莓花色苷的培养液进行48 h的发酵。发酵后三株益生菌的活菌数均增至8.0 lg CFU/mL,达到益生菌摄入标准。相比嗜热链球菌和植物乳杆菌,两岐双歧杆菌更适于在添加了蓝莓花色苷的环境中生长。对比发酵前后样品的抗氧化能力,三株益生菌发酵样的ABTS+·清除能力均显著提升(P<0.05),其中两岐双歧杆菌发酵样增幅最大(P<0.05),但Fe3+还原能力无显著变化(P>0.05)。发酵过程中,乳酸呈增加趋势,而丙酮酸呈先上升后下降的趋势,其中植物乳杆菌和嗜热链球菌的乳酸产量显著高于两岐双歧杆菌(P<0.05)。六种单体花色苷经发酵后均有不同程度的损失,主成分分析表明三株益生菌对花色苷代谢的差异主要来自于对锦葵素-3-半乳糖苷和锦葵素-3-葡萄糖苷的降解差异。分析酚酸组分发现,发酵过程中绿原酸、对香豆酸和咖啡酸的含量总体呈减少趋势,而没食子酸、丁香酸和阿魏酸的含量总体呈增加趋势,不同菌株对酚酸的代谢差异主要来自于对没食子酸、阿魏酸和咖啡酸转化的差异。综上所述,三株益生菌均能代谢花色苷和转化酚类物质,但两岐双歧杆菌更适于发酵含花色苷等酚类物质的体系,该结果可为益生菌发酵花色苷类果蔬汁提供理论依据。