苍术挥发油对溃疡性结肠炎大鼠的改善作用

刘晓兰，张永忠，张俊玲，聂晓博，贾琳，刘会丽△

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性结肠炎症性疾病，其发病机制尚不清楚。近年来研究发现，细胞自噬与炎症细胞因子相互作用造成肠道内环境紊乱，可能是引起慢性肠道炎症的原因之一［1-2］。苍术为中医临床治疗UC的常用药材，挥发油为其主要有效成分［3］。本研究对苍术挥发油干预大鼠实验性UC的作用进行观察，并从细胞自噬基因和炎症反应角度探讨本药对UC的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级雄性SD大鼠85只，7～9周龄，体质量（200±20）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物许可证号SCXK（京）2019-0010。苍术购自河北省中医院，经医院药剂科鉴定为菊科植物茅苍术［Atractylodeslancea（Thunb.）DC.］；以水蒸气蒸馏法提取其中挥发油性成分，出油率为4.5%；实验时配成0.4 g生药/mL，存储于-4℃。美沙拉嗪购自上海艾迪发制药有限公司（批号171013）。2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）5%（W/V）水溶液购自美国Sigma公司，使用前用50%乙醇配成10%（W/V）溶液。大鼠白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。SYBR®Green Master Mix购自美国Thermo公司，微管相关蛋白1轻链3（LC3）兔抗大鼠多克隆抗体（ab51520）购自英国Abcam公司；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，序列见表1。

Tab.1 Sequences of primers for qPCR表1qPCR引物序列

1.2实验方法

1.2.1模型制备 大鼠适应性饲养3 d后，禁食12 h。乙醚轻度麻醉后将直径为2 mm的无菌聚乙烯管插入肛门，深约8cm，将0.25 mL TNBS溶液灌入，结束后维持肛门高位约30 s。另取10只大鼠作为空白对照组，用0.25 mL生理盐水灌肠。模型制备后第5天，若见大鼠大便次数增多，且多为稀便或黏液便，动物体质量减轻，精神萎靡不振则为模型制备成功，实验共制备模型75只，成功50只（67%）。

1.2.2分组与给药 模型制备后第6天，将模型制备成功的大鼠编号后按照随机数字表法分为5组，分别为模型组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组10只。实验按照体表面积比，用人体临床剂量折算出大鼠的剂量，对应的高、中、低剂量组每日分别灌胃苍术挥发油4、2及1 g生药/kg体质量，阳性对照组每日灌胃美沙拉嗪0.36 g/kg体质量，每日1次，每次10 mL/kg，连续10 d。空白对照组和模型组大鼠每日灌胃等体积蒸馏水。

1.2.3体质量检测及取材 模型制备前、给药前和末次给药后分别记录大鼠体质量，观察一般情况和粪便性状。末次给药后，大鼠禁食12 h。将大鼠麻醉后，仰面固定，开腹，快速剪取结肠，部分用10%福尔马林固定，剩余部分快速置于液氮中冻存。

1.2.4苏木精-伊红（HE）染色观察结肠病理形态 将甲醛固定的结肠以石蜡包埋，切成4 μm薄片，常规HE染色，光学显微镜下观察形态学变化。

1.2.5ELISA检测结肠组织中IL-6和TNF-α含量 将所取结肠组织约500 mg在匀浆管中匀浆，用ELISA法检测IL-6和TNF-α含量。

1.2.6qPCR检测结肠组织中Beclin 1和P62mRNA表达水平 取约200 mg结肠组织在液氮中充分研磨，Trizol法提取RNA，测定浓度和纯度后反转录得到cDNA。最后加入相应的引物和SYBR®Green Master Mix后扩增，扩增条件：50℃2min；95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，45个循环。记录Ct值后采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.2.7Western blot法检测结肠组织中LC3水平 取约500 mg结肠组织，加入2 mL蛋白裂解液、2 μL蛋白酶抑制剂和2 μL磷酸酶抑制剂，均浆，离心后取上清，进行蛋白质含量测定。配制10%SDS PAGE凝胶，取约30 μg上样，120 V恒压电泳约2 h。转膜后以5%BSA封闭2 h，分别加入1∶1 000稀释的一抗液4℃过夜。次日加入1∶10 000稀释的二抗，室温孵育1 h后化学发光，以LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的光密度比值作为LC3蛋白相对表达量。

1.3统计学方法 所有数据采用SPSS 23.0进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6组大鼠体质量变化 模型制备前各组大鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。给药前，模型组和各给药组间体质量差异无统计学意义（P＞0.05），但均低于空白对照组（P＜0.05）。给药后，与空白对照组相比，模型组大鼠和低、中、高剂量组大鼠体质量均明显降低（P＜0.05），阳性对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，苍术挥发油中、高剂量组和阳性对照组大鼠体质量升高（P＜0.05），低剂量组差异则无统计学意义（P＞0.05）；与低剂量组相比，高剂量组和阳性对照组大鼠体质量显著提高（P＜0.05），中剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

Tab.2 The changes of body weights during the experiment in six groups表2 6组大鼠实验期间体质量变化 （n=10，g，±s）

Tab.2 The changes of body weights during the experiment in six groups表2 6组大鼠实验期间体质量变化 （n=10，g，±s）

＊＊P＜0.01；a与空白对照组比较，b与模型组比较，c与低剂量组比较，均 P＜0.05；表2～4，图2同

组别空白对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组阳性对照组F模型制备前156.66±14.84 158.89±17.08 161.50±8.78 149.20±10.21 159.10±12.28 160.20±16.05 1.017给药前197.11±20.47 165.22±13.07a 164.50±18.72a 158.70±14.83a 159.30±18.47a 165.60±11.55a 7.061＊＊给药后228.88±20.93 180.11±11.66a 191.63±19.79a 202.40±13.68ab 210.30±18.80abc 217.50±21.90bc 8.497＊＊

Fig.1 The pathological changes of colon tissues in six groups of rats(HE staining,×400)图1 6组大鼠结肠组织病理学变化（HE染色，×400）

2.2 6组大鼠结肠形态变化 光镜下可见，空白对照组大鼠结肠黏膜的上皮细胞完整，隐窝排列整齐（图1A）；模型组大鼠结肠黏膜上皮细胞脱落，隐窝扭曲或萎缩，可见炎症细胞浸润（图1B）；阳性对照组大鼠结肠上皮细胞仅有轻微损伤，隐窝排列规则（图1C）。以苍术挥发油治疗，各剂量组均表现出不同程度上皮细胞虽有脱落或隐窝扭曲，但程度较模型组减轻（图1D、E、F）。

2.3 6组大鼠结肠组织IL-6和TNF-α含量比较 与空白对照组相比，模型组大鼠结肠组织IL-6和TNF-α含量升高（P＜0.05）；与模型组相比，苍术挥发油中、高剂量组和阳性对照组大鼠结肠组织IL-6和TNF-α含量下降（P＜0.05），低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。与低剂量组相比，高剂量组和阳性对照组结肠组织IL-6含量明显降低（P＜0.05），中剂量组、高剂量组和阳性对照组的TNF-α含量差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

Tab.3 The changes of IL-6 and TNF-α levels in colon tissues of the six groups表3 6组大鼠结肠组织IL-6和TNF-α含量的变化（n=10，±s）

Tab.3 The changes of IL-6 and TNF-α levels in colon tissues of the six groups表3 6组大鼠结肠组织IL-6和TNF-α含量的变化（n=10，±s）

组别空白对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组阳性对照组F IL-6（ng/g）12.85±4.03 22.22±2.81a 21.21±5.24a 18.14±4.69ab 16.83±4.72abc 16.95±4.13abc 5.398＊＊TNF-α（ng/g）15.70±2.87 26.06±3.00a 23.47±2.58a 22.30±4.73ab 20.83±3.56ab 20.52±2.44ab 9.762＊＊

2.4 6组大鼠结肠组织中Beclin 1和P62mRNA表达水平变化 与空白对照组相比，模型组大鼠结肠组织中Beclin 1和P62mRNA表达水平升高（P＜0.05）。与模型组相比，苍术挥发油高剂量组和阳性对照组Beclin 1和P62 mRNA表达明显升高（P＜0.05），中剂量组Beclin 1mRNA表达升高（P＜0.05），低剂量组的Beclin 1、P62mRNA和中剂量组的P62mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与低剂量组相比，高剂量组和阳性对照组的Beclin 1、P62mRNA表达显著升高（P＜0.05），中剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

Tab.4 Comparison of the Beclin 1 and P62 mRNA expression levels in colon tissues between the six groups表4 6组大鼠结肠组织中Beclin 1和P62 mRNA表达水平比较 （n=10，±s）

Tab.4 Comparison of the Beclin 1 and P62 mRNA expression levels in colon tissues between the six groups表4 6组大鼠结肠组织中Beclin 1和P62 mRNA表达水平比较 （n=10，±s）

组别空白对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组阳性对照组F Beclin 1 mRNA 0.91±0.34 2.32±0.53a 3.49±1.15a 4.70±1.24ab 5.54±1.24abc 8.40±1.05abc 21.059＊＊P62 mRNA 0.76±0.21 3.94±0.63a 4.93±0.79a 6.67±1.35a 14.67±2.46abc 19.64±2.70abc 57.222＊＊

2.5 6组大鼠结肠组织中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平变化 与空白对照组相比，模型组大鼠结肠组织中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），苍术挥发油低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠结肠组织中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达均显著上调（P＜0.05）。与模型组相比，苍术挥发油中剂量组、高剂量组和阳性对照组大鼠结肠组织中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达均显著上调（P＜0.05），低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。与低剂量组相比，高剂量组和阳性对照组的LC3II/I蛋白表达显著上调（P＜0.05），中剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

Fig.2 Changes of the LC3 Ⅱ/Ⅰ protein expression levels in colon tissues of the six groups图2 6组大鼠结肠组织中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平变化

3 讨论

UC是结肠黏膜层和黏膜下层的连续性炎症反应，其病变主要累及直肠和远端结肠，可引起腹痛、腹泻及黏液脓血便。虽已经过多年研究，但其发病机制至今仍未完全清楚，多数学者认为本病与自身免疫异常有关［4］，而巨噬细胞在机体的免疫调节中充当着重要的角色。巨噬细胞可通过自噬与溶酶体相结合等方式吞噬、消化过多的蛋白质以及衰老、变性、受损的细胞器，实现机体物质再循环，维持细胞代谢平衡和内稳态［5-6］。在肠道炎症反应过程中，炎症细胞因子IL-6、TNF-α等大量分泌，诱导自噬功能缺乏的肠上皮细胞凋亡，使肠道屏蔽功能降低，病变加重［7］。而自噬的形成和调节是受相关基因严格调控的复杂过程。Beclin 1是哺乳动物参与自噬的特异性基因，能介导自噬相关蛋白在自噬泡上定位，调控自噬体的形成与成熟，其表达上调能够刺激自噬的发生［8］。P62则是自噬机制和自噬底物之间的适配器，常被用作检测自噬通路通畅与否［9］。LC3是分布于自噬体膜上的标记蛋白，多以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的形式共存。原本散布于细胞质中的LC3Ⅰ在自噬体形成后会通过偶联磷酸酰乙醇胺形成LC3Ⅱ，定位于自噬体的膜上，直至与溶酶体融合，因此LC3Ⅱ/Ⅰ在一定程度上反映了机体的自噬水平［10］。本研究中，通过5%TNBS灌肠制备UC模型大鼠，可见结肠组织中IL-6、TNF-α等炎症因子水平升高，结肠组织中Beclin 1和P62表达上调，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达上调，均表明UC大鼠自噬功能受到抑制，肠道内环境紊乱，与临床报道相一致［11-12］。

目前临床UC常以水杨酸制剂、糖皮质激素类药物治疗，虽有一定疗效，但不良反应较大，限制了其应用。近年来，中医药治疗UC因疗效显著，不良反应轻微而受到关注。中医认为UC病机是由于机体正气虚衰，阴阳失衡，造成体内“湿”“热”“瘀”邪兼夹转化，邪伏于里，出现缠绵难愈的表现［13］。从现代医学角度来看，UC“正虚邪实”可能与机体免疫功能低下引起的自噬功能异常，炎性因子堆积有关［14］。苍术为常用芳香化湿药，具有燥湿健脾，祛风散寒功效，临床常以苍术为君药治疗UC［15］。宁海荣等［16］研究发现苍术水煎液具有抗大鼠UC的作用，其机制与抗氧化、抑制肠道氧化应激损伤有关。本研究结果表明，苍术挥发油对大鼠结肠组织损伤有明显保护作用，其作用与抑制IL-6、TNF-α释放，上调自噬基因Beclin1、P62mRNA表达和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达有关。