正交设计优化银杏叶中4 种活性成分综合提取工艺*
2020-10-22曹春月陈前袆王黔阳
曹春月，陈前袆，王黔阳，何 珺**
（1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省生化工程中心，贵州 贵阳 550025）
前 言
银杏叶（Ginkgo biloba L.）主产于中国，我国银杏资源占世界总量的80%。目前我国银杏叶年产约为1 万吨以上，年产银杏叶提取物约为620 吨，银杏产业年总产值280 多亿元，国内银杏叶制剂年产值约为 70 亿元[1]。
银杏叶中主要有黄酮类、萜内酯类、有机酸类、聚异戊烯醇类、多糖类等活性成分[2～4]。但对其黄酮类、内酯类成分的研究开发较多，而对其中的其他成分活性研发较少。黄酮类具有多种功能，比如抗氧化、清除自由基、抗衰老等[5～6]；内酯类化合物具有降血脂、保护神经等药理活性；莽草酸具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性，同时是达菲药物的重要成分，市场需求量很大[7]；绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化作用、降血压和降血脂等功能，在食品上作为一些果汁的护色剂以及水果保鲜作用[8～11]。目前，莽草酸有少量专利报道，绿原酸的提取大部分在金银花以及杜仲这两种产物上，而在银杏叶中从未有过研究。本文主要对银杏叶中总黄酮、总内酯、莽草酸以及绿原酸4 种活性成分进行综合提取，采用了正交试验对提取工艺参数进行优化研究，为银杏叶综合利用提供参考数据。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪（Agilent1260，美国）；紫外可见分光光度计（UV757CRT，上海佑科仪器仪表有限公司）；超声波清洗器（KQ3200DE，昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平（BT25S，塞多利斯科学仪器（北京）有限公司）。
银杏叶于2016 年9 月采摘自江苏省邳州市，具有5 年树龄。莽草酸标准品（批号18071724，上海同田生物技术股份有限公司）、绿原酸标准品（批号09081633，上海同田生物技术股份有限公司）、银杏内酯A（10011506，中国食品药品检定研究院）、银杏内酯B（110863-200508，中国食品药品检定研究院）、银杏内酯C（09102111，中国食品药品检定研究院）、白果内酯（09082711，中国食品药品检定研究院）、槲皮素（110862-201510，中国食品药品检定研究院）、山柰素（110861-201310，中国食品药品检定研究院）、异鼠李素（110860-201410，中国食品药品检定研究院）；甲醇为色谱纯；水为纯水；其他试剂为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 银杏叶前处理
将银杏叶用60℃烘干，粉碎后装袋备用。
1.2.2 提取液的制备
分别精密称取约2g 银杏叶粉末，按照表1 提取温度、提取时间、料液比以及乙醇浓度4 个因素，进行提取实验，通过漏斗过滤即得，记录提取液体积V。
表1 因素水平表（n=3）Table 1 The factors and levels（n=3）
1.2.3 黄酮、内酯、绿原酸、莽草酸含量测定
1.2.3.1 对照品溶液的制备
总黄酮对照品溶液制备 精密称定三种对照品：槲皮素48.2mg、山柰素69.5mg、异鼠李素60.1mg，放置于100mL 容量瓶中，然后加入甲醇溶解后定容至刻度，得槲皮素、山柰素、异鼠李素浓度分别为482、695、601μg·mL-1的混合总黄酮对照品溶液。
总内酯对照品溶液制备 精密称定四种对照品：银杏内酯A132.1mg、银杏内酯B26.6mg、银杏内酯C51.7mg、白果内酯156.2mg，放置于100mL 容量瓶中，然后加入甲醇溶解后定容至刻度，得到的银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯浓度分别为 1321、266、517、1562μg·mL-1的混合总内酯对照品溶液。
绿原酸对照品溶液制备 精密称定绿原酸对照品21.2mg，放置于100mL 容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，配置成0.212mg·mL-1绿原酸对照品溶液。
莽草酸对照品制备 精密称定莽草酸对照品105.3mg，放置于100mL 容量瓶中，加30%甲醇溶解并定容至刻度，配置成0.1053mg·mL-1莽草酸对照品溶液。
1.2.3.2 供试品溶液的制备
总黄酮供试品制备 取银杏叶正交提取样液1mL 置于10mL 具塞管中，加4mL 液体水解液（甲醇∶纯水∶盐酸=7∶2∶1），放置于68℃水浴锅中，3h 后取出放置冷却于室温下，用0.45μm 滤膜过滤，得总黄酮供试品溶液。
总内酯供试品制备：取适量银杏叶提取液用Al2O3过滤，得总内酯供试品溶液。
莽草酸供试品制备：取适量银杏叶提取液用0.45μm 滤膜过滤，得莽草酸供试品溶液。
绿原酸供试品制备：取适量银杏叶提取液用0.45μm 滤膜过滤，得莽草酸供试品溶液。
1.2.3.3 HPLC 测定色谱条件
莽草酸色谱条件：Inertsil 氨基柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈 -0.1%磷酸（15∶85），流速为 1mL·min-1，波长为 213nm，进样量 10μL，柱温25℃。
总黄酮色谱条件：C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-0.4%磷酸水（50∶50），流速为 1mL·min-1，波长为 360nm，进样量 10μL，柱温50℃。
总内酯色谱条件：采用C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇 - 水（28∶72），流速为 1mL·min-1，波长为 360nm，进样量 10μL，柱温50℃。
绿原酸色谱条件：采用C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.2%磷酸水（11∶89），流速为0.8mL·min-1，波长为324nm，进样量10μL，柱温 35℃。
2 结果与讨论
2.1 综合评分的计算
综合评分=总黄酮含量评分＋萜类内酯含量评分＋绿原酸含量评分+莽草酸含量评分；总黄酮含量评分=（总黄酮含量/ 最大总黄酮含量）×100×0.25；萜类内酯含量评分= （萜类内酯含量/最大萜类内酯含量）×100×0.25；莽草酸含量评分=（莽草酸含量/最大莽草酸含量）×100×0.25；绿原酸含量评分=（绿原酸含量/最大绿原酸含量）×100×0.25。
2.2 提取正交试验结果
2.2.1 莽草酸正交试验结果
表2 正交试验数据与结果Table 2 The orthogonal test data and results
从该莽草酸正交试验结果中，可以看出：影响银杏叶莽草酸含量的因素主次为D＞B＞C＞A，也就是料液比的影响最高，其余依次为提取温度、醇浓度，影响最小的为提取时间。并且由k 值比较可以知道，在料液比的比较中，k3＞k2＞k1，所以料液比为1∶15 为最优。同理，可以分析得出最优工艺为A3B1C3D3，即提取时间3h、提取温度50℃、料液比1∶15、醇浓度 70%。
2.2.2 总黄酮正交试验结果
表3 正交试验数据与结果Table 3 The orthogonal test data and results
从该总黄酮正交试验结果中，可以看出：影响银杏叶总黄酮含量的因素主次为D＞C＞A＞B，即料液比的影响最高，其余依次为醇浓度、提取时间，影响最小的为提取温度。并且由k 值比较可以知道，在温度的比较中，k2＞k1＞k3，所以提取温度60℃为最优。同理，可以分析得出最优工艺为A3B2C3D3，即提取时间3h、提取温度60℃、料液比1∶15、醇浓度70%。
2.2.3 总内酯正交试验结果
表4 正交试验数据与结果Table 4 The orthogonal test data and results
从该总黄酮正交试验结果中，可以看出：影响银杏叶总内酯含量的因素主次为D＞B＞A=C，即料液比的影响最高，其余为提取温度、提取时间和醇浓度影响一样。并且由k 值比较可以知道，在提取时间的比较中，k2＞k3＞k1，所以提取时间 2h 为最优。同理，正交试验中可以分析得出最优工艺为A2B1C2D3，即提取时间2h、提取温度50℃、料液比1∶15、醇浓度50%。
2.2.4 绿原酸正交试验结果
表5 正交试验数据与结果Table 5 The orthogonal test data and results
从该绿原酸正交试验结果中，可以看出：影响银杏叶绿原酸含量的因素主次为D＞C＞B＞A，即料液比的影响最高，其余为醇浓度、提取温度、提取时间。并且由k 值比较可以知道，在醇浓度的比较中，k3＞k2＞k1，所以醇浓度为70%为最优。同理，正交试验中可以分析得出最优工艺为A1B1C3D2，即提取时间1h、提取温度50℃、料液比1∶10、醇浓度70%。
2.3 4 种活性成分提取正交试验综合评分表
表6 综合评分表Table 6 The comprehensive score sheet
通过表6 和表7 可以明显看出，影响因素顺序依次为D 料液比＞C 乙醇浓度＞B 提取温度＞A 提取时间，其中，因素D 的改变对提取效果具有显著影响。每个水平对该试验结果的影响大小依次为A2＞A3＞A1，B1＞B2＞B3，C3＞C2＞C1，D3＞D2＞D1。从极差分析以及方差分析得出的结果综合考虑，得到银杏叶最佳提取工艺：A2B1C3D3。即提取时间2h，提取温度为50℃，料液比为1∶15，乙醇浓度为70%。
2.4 验证试验
称取银杏叶3 份，按照优选提取工艺A2B1C3D3条件进行提取后，可以得到绿原酸、莽草酸、总黄酮以及内酯的含量，从而计算出评分，从表8 中可以看到综合评分平均达95.48 分以上，表明该工艺稳定、可行，可用于银杏叶中4 种活性成分的综合提取。
表8 验证试验Table 8 The verification test
3 结 论
采用正交试验法优化银杏叶中莽草酸、总黄酮、总内酯、绿原酸4 种活性成分的提取工艺，通过比较，最终的优化方案为：料液比1∶15、醇浓度70%、提取时间2h、提取温度50℃。这样的优化方案最大的优点在于能够同时有效地将银杏叶中莽草酸、绿原酸、总内酯、总黄酮最大程度的提取出来，为银杏叶中这4 种活性成分的综合利用工艺提供一定的参考价值，对提高银杏叶的综合利用是很有意义的。
