维吾尔药复方待比地力对顺铂所致小鼠肾损伤的保护作用

舒广文，阿尔斯拉·玉苏甫，邱韵涵，戴晨曦，邓旭坤

(中南民族大学 药学院，民族药学国家级实验教学示范中心，武汉 430074)

顺铂(cisplatin，CP)是一种较常见的化疗药物，对卵巢癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌和睾丸癌等实体肿瘤都具有较好的控制效果.但是，大量的顺铂会积累在肾脏中，引起肾小球萎缩、肾小管空泡变性等肾显微结构改变，从而导致肾小球滤过率降低，血清中肌酐(creatinine，Cr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平增加等肾功能异常.顺铂对肾脏的毒性是其常见不良反应之一，严重限制了该药的临床应用.

NLRP3炎症小体是由NOD 样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)组成的蛋白复合体.在病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或危险相关分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)的作用下，NLRP3炎症小体被激活.活化的NLRP3炎症小体可引发炎症细胞因子IL-1β和IL-18的释放或诱导细胞焦亡[1].研究表明，激活NLRP3炎症小体在一些毒物诱导高等动物肾损伤的发生过程中起到了关键性作用[2，3].这提示NLRP3可作为干预顺铂诱导肾损伤的潜在分子靶点.

维吾尔药复方待比地力(DBD)是新疆维吾尔族自治区和田地区的维吾尔医院习用的一种医院制剂，常制成片剂、丸剂或蜜膏剂，由以玫瑰花为主的19味药材组成[4].维语“待比地力”即“含有玫瑰花”之意.传统维医认为，DBD能消炎、利肝、通滞，常用于肝炎、腹水和水肿等疾病的治疗[5].肾功能异常与水肿的发生紧密相关.然而，目前尚不清楚DBD是否能够缓解顺铂诱导的肾损伤.因此，本文探讨了DBD对顺铂所致小鼠肾损伤的保护作用及可能机制.

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂与仪器

SPF级雄性昆明小鼠40只(8周龄，23±2 g)，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018.适应性喂养3 d后开始实验.

DBD蜜膏剂(新疆墨玉县维吾尔医院)；BUN、Cr、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(南京建成生物研究所)；肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素(IL-6)酶联免疫(ELISA)测定试剂盒(武汉贝茵莱)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(碧云天).兔抗NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β抗体；鼠抗β-actin抗体(武汉三鹰).

多功能酶标仪(SMP-R8，北京维德维康)；低温离心机(D3024R,赛洛捷克)；微型旋涡混合仪(WH-3，上海沪西分析仪器).

1.2 动物模型建立、生化分析与ELISA实验

40只雄性昆明小鼠随机分为正常组、模型组、DBD低剂量给药组(0.64 g/kg)和DBD高剂量给药组(1.28 g/kg)，每组10只.小鼠的给药剂量根据药品说明书中规定的人服药剂量换算，依据文献报道的方法进行动物的造模与给药[6].正常组小鼠每天灌胃生理盐水，持续10 d；模型组小鼠每天灌胃生理盐水，DBD低、高剂量给药组分别灌胃给予不同剂量的DBD，连续7 d.第7 d给药2 h后，除正常组外，其余小鼠腹腔注射20 mg/kg的顺铂.然后，各给药组继续灌胃给药3 d.第10 d，小鼠眼眶静脉丛取血并立即处死小鼠，取右肾用10%福尔马林溶液固定；左肾用生理盐水冲洗后快速冷冻保存于-80 °C.按试剂盒说明书方法，测定血清中的BUN和Cr含量以及肾组织中MDA、GSH、SOD和CAT含量.ELISA试剂盒测定肾组织中TNF-α、IL-1β及IL-6的含量.

1.3 小鼠肾组织总蛋白免疫印迹分析

参考文献方法[6,7]，取适量肾组织，制备肾组织总蛋白提取物，蛋白定量后进行免疫印迹检测.用Image J软件对蛋白质条带的灰度进行半定量分析.

1.4 小鼠肾组织免疫组化染色

将固定好的小鼠肾脏用石蜡包埋并切成5 μm厚的组织切片，根据HE染色试剂盒说明书规定的步骤操作，进行组织切片的HE染色.参考文献方法[8]，进行组织切片的免疫组化染色.

1.5 数据处理

2 结果

2.1 DBD对顺铂诱导小鼠肾损伤的保护作用

如图1(a)和图1(b)所示，与正常小鼠相比，顺铂诱导肾损伤模型小鼠血清中BUN和Cr水平均有明显提高(P<0.01).给予不同剂量的DBD均能明显降低模型小鼠血清中的BUN和Cr水平(P<0.05或P<0.01)，且下降程度与DBD给药剂量呈正相关.

如图1(c)所示，正常小鼠的肾组织中，肾小球和肾小管无变性、坏死或上皮细胞脱落等病理现象.在模型组小鼠的肾脏中，可见明显的组织空泡化和肾小球萎缩.DBD明显改善了顺铂诱导的小鼠肾脏组织病理学变化.

与正常组比较，## P<0.01；与模型组比较，** P< 0.01，*P< 0.05

2.2 DBD缓解顺铂诱导的小鼠肾脏内氧化应激

肾内氧化应激是顺铂诱导肾损伤的标志之一.与正常小鼠相比(表1)，模型组小鼠在注射顺铂后肾组织中MDA含量显著升高，GSH、SOD和MDA水平则显著降低(P<0.01).这提示模型小鼠的肾脏中发生了明显的氧化应激.与模型组相比，DBD各剂量组肾内MDA水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)，GSH、SOD和MDA水平均有升高(在高剂量组中P<0.01).

表1 DBD对肾损伤小鼠肾脏内氧化应激指标水平的影响(n = 10)

2.3 DBD抑制顺铂诱导的小鼠肾脏炎症反应

与健康小鼠相比(表2)，模型组小鼠肾内炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平均有明显升高(P<0.01).给予DBD能下调模型小鼠肾内各炎症因子的含量(在高剂量组中P< 0.05或P< 0.01)，且下调程度与给药剂量呈正相关.

表2 DBD对肾损伤小鼠肾脏内炎症因子含量的影响(n = 10)

2.4 DBD下调模型小鼠肾脏内NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β的蛋白表达水平

免疫印迹结果表明，在顺铂的作用下，小鼠肾脏内NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白表达水平均有明显上调(P<0.01).与模型组相比，DBD各剂量组小鼠肾脏中这些蛋白的表达水平均有明显下调(P<0.05或P< 0.01)，且下调幅度与DBD给药剂量呈正相关(图2).免疫组化实验进一步证实了以上研究结果(图3).

注：与正常组比较，## P< 0.01；与模型组比较，*P<0.05，** P< 0.01

图3 免疫组化检测各组小鼠肾脏内NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白表达水平(400 ×)

3 讨论

在顺铂的作用下，小鼠血清BUN与Cr水平明显上升，肾脏显微结构明显改变，肾脏内发生了明显的氧化应激反应，而 DBD能显著缓解以上病变，且缓解效果与给药剂量呈正相关.以上研究结果显示DBD能干预顺铂诱导的小鼠肾损伤.为探讨DBD干预顺铂诱导肾损伤的机制，研究进一步分析了DBD对各组小鼠肾脏内炎症反应的影响.在顺铂的作用下，肾脏内3种主要炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均明显升高.DBD则显著下调了模型小鼠肾脏内炎症因子的含量，提示抑制肾脏内炎症反应在DBD发挥肾脏保护活性过程中扮演了重要角色.

在无病原体感染的情况下，NLRP3炎症小体的激活是启动肾脏内炎症反应的关键性分子事件之一[9].研究表明，顺铂可上调NLRP3 炎症小体各主要组分的表达与组装，从而进一步引起肾脏炎症反应与肾细胞死亡[10].而敲除NLRP3编码基因或NLRP3抑制剂MCC950均能抑制顺铂诱导的肾损伤[11].在天然化合物黄芪甲苷和杜鹃素的作用下，顺铂对肾脏内NLRP3、ASC和caspase-1基因表达的上调作用被抑制，顺铂诱导的肾脏内炎症反应与肾损伤也得到了相应的缓解[12，13].与以上文献报道一致的是，在本研究中，免疫印迹和免疫组化实验的结果均表明，模型小鼠肾脏内NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白表达水平明显高于正常小鼠.DBD则显著下调了以上蛋白在模型小鼠肾脏内的表达.这些结果提示下调模型小鼠肾脏内NLRP3炎症小体各组分的表达与DBD缓解顺铂诱导的肾内炎症反应，干预顺铂所致肾损伤紧密相关.

在顺铂的作用下，肾脏内发生氧化应激[14].肾内的氧化应激可激活NF-κB信号通路，从而上调NF-κB介导的NLRP3炎症小体各主要组分的表达[15].杜鹃素可激活肾内Nrf2抗氧化通路，诱导Nrf2下游抗氧化酶HO-1和NQO1的表达，从而抑制顺铂对NLRP3、ASC和caspase-1基因表达的上调作用[13].DBD的主要组分玫瑰花瓣，含有槲皮素、樱黄素、山奈酚等黄酮类化合物[16]，它们在化学结构上与杜鹃素高度相似.研究还观察到DBD对顺铂所致的肾脏内氧化应激具有明显的缓解作用.这提示抗氧化可能在DBD抑制肾内NLRP3炎症小体通路过程中起到了关键性作用.