3-MA对缺氧/复氧心肌细胞自噬及凋亡的影响*

张新会，罗文龙，裴汉军

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院心内科，内蒙古包头 014010)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction)是由于冠状动脉血液供应急剧减少，甚至血管完全闭塞血流中断，使供应部位的心肌功能受损，不能满足人体需要，进而引起心脏功能障碍，造成患者死亡。近年来我国急性心肌梗死死亡人数急剧增加。针对急性心肌梗死的治疗，尽快恢复血流是治疗的关键[1]。现有治疗急性心肌梗死的主要手段为溶栓、经皮冠状动脉介入、紧急冠状动脉旁路移植等恢复血流措施。但以上措施均受时间限制并存在缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury)的可能。再灌注后会促进活性氧的生成、缺血组织中炎性因子的产生，内质网应激反应，从而使细胞凋亡[2]。但目前缺血再灌注损伤机制还没有完全清楚。

自噬是细胞通过吞噬自身细胞质内的物质(包括翻译异常的蛋白质或功能失调的细胞器)后，形成囊泡，包裹上述内容物，运送到溶酶体，降解内容物，实现细胞内自我更新和代谢的过程[3]。它对细胞的稳态维持起到了十分重要的作用。在多种疾病发生、发展过程中起到至关重要的作用。本实验在体外模拟缺血、再灌注损伤对心肌细胞的影响，采用C57BL/6J乳鼠心肌细胞并对细胞抑制自噬后进行缺氧/复氧处理，观察细胞凋亡情况以及凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白的表达，为自噬在心肌细胞缺氧/复氧过程中的作用提供了理论依据，为后续自噬在缺血再灌注损伤的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组 新生C57BL/6J乳鼠(出生在24 h内，雌雄不计)，由北京斯贝福生物技术有限公司提供(许可证号：SCXK(京)2019-0010)。取48只C57BL/6J乳鼠，随机分成3组,正常培养组(C)、缺氧复氧组(H/R)、抑制自噬联和缺氧复氧组(3-MA+H/R)每组16只，使用胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原蛋白酶分离心肌细胞，使用完全培养基(含有10 %胎牛血清，1 %青、链霉素的低糖DMEM培养基)进行培养，培养7 d后，正常对照组使用完全培养基继续培养。H/R组更换无血清、无糖、无谷氨酰胺DMEM培养基，在低氧培养箱(37 ℃，1 %O2,5 %CO2,94 %N2)放置3 h，后更换完全培养基放入正常培养箱(37 ℃，21 %O2,5 %CO2)6 h。3-MA+H/R组在缺氧前3 h加入3-MA使其终浓度为10mM，后进行缺氧/复氧处理同H/R组。

1.1.2实验伦理 本实验研究严格遵守《实验动物管理条例》，并获得内蒙古科技大学包头医学院动物试验伦理委员会批准。

1.1.3实验试剂及设备 胰蛋白酶(含乙二胺四乙酸(EDTA))、胰蛋白酶(不含EDTA)、DMEM低糖培养基、Hanks平衡盐溶液(不含钙镁)、5-溴-2-脱氧尿核苷(Brdu)、BSA 、PBS缓冲液、tritonX-100(英国sigma公司)；胶原蛋白酶Ⅱ型、胎牛血清(美国gibco公司)；抗重链心肌蛋白肌球抗体、Bcl-2抗体、Cyt c抗体、Beclin-1抗体(英国Abcam公司)；cy3标记山羊抗小鼠二抗(北京碧云天生物科技有限公司)；DAPI(北京中杉金桥公司)；驴血清、Tween-20、4 %多聚甲醛(北京索莱宝生物技术公司)；青、链霉素(美国scien cell公司)；乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成公司)； Annexin-V-FITC-PI细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；超净台、细胞培养箱、离心机(美国thermo公司)；muse细胞技术仪(德国MercK公司)，倒置荧光显微镜(德国leica公司)，磁力搅拌水浴锅(德国IKA公司)，BD-Accuri-C6流式细胞仪(美国BD公司)，MiniProtean3电泳、转印槽(美国BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1心肌细胞的培养 C57BL/6J乳鼠用75 %的酒精消毒10 s后，剪开胸腔，暴露心脏用镊子快速夹取心脏，放入预冷的不含钙镁的Hanks溶液中，重复此过程直至处理完所有小鼠，用剪刀修剪乳鼠心脏保留呈椭圆形的心尖部分，剔除心房，同时再次挤压心脏，挤出心腔内血液，放入新的预冷的不含钙镁的Hanks溶液中进行清洗。将心脏剪成肉末状，将每组心脏分别进行消化。将16只乳鼠心脏移入50 mL烧瓶中(内含搅拌子)封闭烧瓶，加入10 mL 0.06 %胰蛋白酶，将烧瓶放入盛有预温在37 ℃水的磁力搅拌器中，将转速控制在30～40 r/min，消化10 min。将上清液去除。将10 mL 0.04 %Ⅱ型胶原蛋白酶放入烧杯，继续放入37 ℃的水中，将转速控制在30～40 r/min，消化8 min，加入10 mL 10 %胎牛血清的DMEM低糖完全培养基，中和Ⅱ型胶原蛋白酶。吸取上清液，放入50 mL离心管，将离心管放置在37 ℃细胞培养箱内。加入10 mL 0.04 %Ⅱ型胶原蛋白酶继续消化，重复上述步骤，5～7次，可将所有心脏组织消化完毕。将所有上清液经过200目滤网，清除未被消化的心脏组织，收集过滤出的液体于新的50 mL离心管中。将离心管放入离心机内1 000 r/min,离心5 min，除去上清液。用6 mL 10 %胎牛血清的低糖DMEM完全培养基重悬细胞，重悬后放入直径10 cm的培养皿中。放入37 ℃，5 %CO2恒温的细胞培养箱中，静置90 min后，取出培养皿，在无菌操作台上操作，吸取培养基放入50 mL离心管内。用muse计数仪测定细胞计数，以加入完全培养基调整细胞浓度为1×106/mL，加入Brdu使其终浓度为0.1 mmol/L，六孔板每孔放置2 mL细胞悬液，每组4个复孔，观察细胞形态及搏动状态。每3 d换1次液。

1.2.2肌细胞鉴定 培养第3 d行细胞纯度鉴定，用免疫荧光法鉴定心肌细胞。具体方法如下：配置浓度为1 %BSA及的PBST,一抗为抗重链心肌肌球蛋白抗体，二抗为cy3标记山羊抗小鼠抗体(带有红色荧光)。用PBS冲洗细胞2次。4 %多聚甲醛常温下固定心肌细胞10 min后，用PBS清洗细胞2次，每次5 min，加入0.25 %tritonX-100室温下透化细胞10 min，10 %驴血清封闭30min，加入浓度为1 %BSA的PBST，稀释的一抗(1∶200)，常温下摇床1 h，再次用PBS清洗细胞，避光加入1 %BSA的PBST稀释的cy3标记山羊抗小鼠二抗(1∶500)，孵育1 h，加入DAPI，倒置荧光显微镜下计算心肌细胞纯度，每个视野选取100个细胞，被染色的细胞数量，即为此视野心肌细胞数，本实验共选取4个视野。

1.2.3心肌细胞活力测定 细胞活力可以直观的从细胞搏动状态反应出来，自细胞培养48 h后，每天10：00(T1)，14：00(T2)，18：00(T3)，22：00(T4)观察第3～9 d细胞搏动情况。

1.2.4Elisa法测定 LDH 缺氧/复氧后将各组细胞培养液收集后，在1 000 g、4 ℃，离心15 min，吸取上清液，按试剂盒要求添加试剂，在酶标仪450 nm波长测定光密度值。

1.2.5心肌细胞凋亡测定 将细胞培养板(6孔板)取出，吸取培养基放入2 mL离心管内，每孔加入预冷的PBS 2 mL清洗细胞2次，每孔加入1 mL 0.25 %胰蛋白酶(不含EDTA)，在显微镜下观察细胞消化情况。观察细胞约50 %消化漂浮时，加入离心管内的培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使剩余细胞脱落，将细胞培养孔内混合培养基吸入15 mL离心管，用预冷的PBS清洗，清洗后将离心管放入离心机内，1 000 g，5 min。离心后将离心管内的上清液弃去，加入2 mL PBS轻轻吹打细胞，使之混合均匀。取200 μL放入muse细胞计数仪计数。将离心管放入离心机内，1 000 g，5 min。根据计数，计算消化获取的细胞数，再次给与离心1 000 g，5 min，加入适量1×binding buffer，调整细胞密度为1×106/ mL。取100 μL binding buffer(1×105)转移到2 mL离心管内。加入5 μLAV-FITC和5 μL PI，轻轻震荡混匀。在室温(20～25 ℃)避光孵育15 min。每管加入400 μL 1×binding buffer。放置于冰上，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6Western Blot检测Bcl-2、Cytc、Beclin-1蛋白的表达 按照总蛋白提取方法，在冰上进行。在细胞培养孔加入裂解液及蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂、PMSF提取总蛋白，充分裂解细胞，收集裂解产物放入离心管，将离心管放入离心机内，12 000 g，4 ℃，离心10 min。吸取上清液，-80 ℃贮存备用。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒给与测定各组蛋白浓度，根据样品浓度加入LDS Sample Buffer(4×)，加入水，配制成1 μg/ mL蛋白浓度。金属浴加热配制好的蛋白液，100 ℃，10 min变性。变性完毕后进行电泳、转膜完毕后，加入5 %BSA室温封闭2 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜，1×TBST洗膜，每次10 min，共洗3次。加入二抗，室温孵育2 h，1×TBST洗膜，每次10 min，共洗3次。加入ECL底物进行曝光，用Image J软件进行灰度值分析。

2 结果

2.1乳鼠心肌细胞形态 心肌细胞2～4 h开始贴壁，24 h大部分贴壁，刚贴壁的心肌细胞呈类圆形，贴壁后逐渐伸展伸出伪足，少数可出现博动，细胞折光性能好，呈星型或梭型。培养48 h后，大多数心肌细胞伸出伪足，搏动的细胞数量增加。培养72 h后，细胞交织成网，相连组成合胞体，规律性搏动。培养第5 d后，细胞密集，胞体明显增大，形成细胞簇，搏动次数更快。形态此后不再发生明显变化，细胞从第3 d开始出现一致搏动，在细胞培养2周内，搏动次数在50～130次/min，2周后细胞搏动次数较低，有时已停止搏动。见图1。

2.2乳鼠心肌细胞鉴定 倒置荧光显微镜倒置荧光显微镜下观察心肌细胞。红色为荧光标记的抗重链心肌肌球蛋白抗体，蓝色为细胞核，经测定纯度平均可达94 %。见图2，表2。

表2 心肌细胞纯度鉴定结果

2.3心肌细胞活力检测 自第3 d开始细胞搏动次数逐渐增高。与第3 d细胞活力相比，细胞培养4～9 d搏动次数较第3d明显升高，差异明显具有统计学意义(P<0.01)。第6 d与第7 d活力相比，第7 d搏动明显增高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。第8 d与第7 d活力相比，搏动较前有所下降，差异均具有统计学意义(P<0.01)。因此细胞培养至第7 d进行缺氧/复氧处理。见表3，图3。

表3 心肌细胞活力测定次/min)

2.4LDH测定结果 正常组测定细胞培养液LDH数值为(63.08±13.302 U/L)，经缺氧/复氧处理后，H/R组LDH数值(156.20±15.880 U/L)明显高于正常培养组，差值具有统计学意义(P<0.01)。3-MA+H/R组LDH数值(227.30±8.618 U/L)同样高于正常组(P<0.001)，与H/R比较，仍明显升高，具有统计学意义(P<0.01)。见图4。

2.5心肌细胞凋亡率测定 检测结果显示，正常对照组细胞凋亡率为(13.33±2.810) %，经缺氧复氧处理后，H/R组凋亡率为(40.08±2.457) %明显高于正常对照组，差值具有统计学意义(P<0.001)。3-MA+H/R组LDH数值(55.98±3.282)%，同样高于正常组(P<0.001)，与H/R比较，仍明显升高，具有统计学意义(P<0.01)。见图5。

2.6Western Blot检测凋亡相关蛋白及自噬蛋白 Bcl-2表达结果显示：与正常组相比H/R组Bcl-2蛋白表达量明显低于正常培养组，差值具有统计学意义(P<0.01)。3-MA+H/R组Bcl-2蛋白表达量同样明显低于正常组(P<0.001)，与H/R比较，仍明显明显降低，具有统计学意义(P<0.001)。见图6A、B。

Cyt c表达结果显示：与正常组相比H/R组Cyt c蛋白表达量明显高于正常培养组，差值具有统计学意义(P<0.01)。3-MA+H/R组蛋白表达量同样明显低于正常组(P<0.01)，与H/R比较，仍明显明显降低，具有统计学意义(P<0.01)。见图6A、C。

Beclin-1表达结果显示：与正常组相比H/R组Beclin-1蛋白表达量明显低于正常培养组，差值具有统计学意义(P<0.001)。3-MA+H/R组Beclin-1蛋白表达量同样明显低于正常组(P<0.001)，与H/R比较，仍明显降低，具有统计学意义(P<0.001)。见图6A、D。

3 讨论

LDH参与糖酵解过程中催化丙酮酸转化为L-乳酸、NADH转变为NAD+，是一种非常重要的酶。细胞损伤能够使乳酸脱氢酶从细胞质释放到细胞外，LDH水平的高低反应细胞的损伤程度。Ⅲ型磷酸肌醇3磷酸激酶(PI3KC3)的活性对于形成自噬膜结构是非常重要的，参与自噬的启动和进展。3-MA通过抑制PI3KC3的活性，抑制自噬。Beclin-1即BECN1通过介导自噬相关蛋白定位于吞噬泡，促进自噬体的成熟，进而促进细胞发生自噬。PI3KC3与Beclin-1结合促进自噬体的形成及成熟，这是细胞内自噬发生的关键条件。因此Beclin-1蛋白表达水平反映出细胞内自噬的水平[4]。Bcl-2属于B细胞淋巴瘤2(bcl-2)家族，分布在胞质和质膜上，起到抗凋亡的作用[5]。细胞色素C(Cyt c)在细胞凋亡过程中起到至关重要的作用,从线粒体上释放细胞色素C是凋亡开始的第一步，细胞色素C的释放胞浆中与胞浆蛋白酶激活因子1(Apaf-1)形成凋亡小体和激活Caspase，加速细胞凋亡[6]。通过以上数据我们可得到如下结论：缺氧/复氧导致LDH产生增加，凋亡率增加，Bcl-2、Beclin-1表达减少，Cyt C表达增加，使用自噬抑制剂进一步加重缺氧/复氧损伤，Bcl-2、Beclin-1表达显著减少，Cyt C表达明显增加促进细胞凋亡，与缺氧组与正常组相比数据均有统计学意义(P<0.01)。因此增加缺氧/复氧心肌细胞内的自噬水平，可能会减轻缺氧/复氧所带来的的心肌细胞损伤。近年来研究普遍认为适度自噬对可以减轻心肌细胞起到保护作用，过度自噬会加重缺血再灌注损伤。有研究表明microRNA-122的敲除通过诱导PTEN-PI3K-Akt信号介导的自噬保护心肌细胞免受缺氧/复氧损伤，表明抑制microRNA-122的表达可能是治疗急性心肌梗死的有效靶点[7]。阿托伐他定通过激活AMPK/mTOR途径促进急性心肌梗死模型小鼠心肌细胞自噬，抑制凋亡减少了心肌梗死面积避免心脏功能恶化，对心肌缺血/再灌注损伤起到保护作用[8]。研究表明结扎小鼠左前降支后使用吗啡处理后再给与再灌注发现自噬明显减弱，心肌梗死范围明显减少[9]。此外研究报道长期尼古丁暴露下的小鼠经缺血再灌注损伤后心脏内自噬水平显著增加，导致了心脏损伤和心功能不全，使用自噬抑制剂后心脏自噬降低，心脏功能较前明显改善，表明抑制过度自噬可能会对缺血再灌注损伤起到保护作用[4]。因此细胞自噬状态根据不同的条件处于变化之中，调节不同的条件下的自噬状态，可能成为治疗缺血/再灌注损伤的有效治疗方案。

综上所述，本文研究表明在C57BL/6J乳鼠心肌细胞给与血氧复氧处理抑制自噬后细胞损伤及细胞凋亡明显增加，适度的增加自噬可能会减轻缺血再灌注损伤，为后续的研究提供了理论依据。虽然目前对自噬及如何干预自噬治疗缺血再灌注损伤做了大量研究，但缺血再灌注损伤中调节机制及信号通路仍未完全明确，还需要进一步探索[10]。