EXAKT 硬组织切磨技术在龋齿切片观察中的应用

徐倩 李纾( 通讯作者)

（山东大学齐鲁医学院口腔医学院＜山东省口腔组织再生重点实验室＞＜山东省口腔生物材料与组织再生工程实验室＞ 山东 济南 250012）

龋齿是人类口腔常见疾病，龋病的发生严重影响人们的身体健康，尤其是儿童[1-3]，因此全面分析龋病发生的成因并及早预防治疗具有非常重要的意义[4]。将龋齿制成石蜡切片进行组织形态学观察是龋齿研究中一种常用手段，牙齿本身硬度较高，制成石蜡切片过程中需要对其进行脱钙处理，这一过程往往会浪费数月的时间，以EXAKT 硬组织切磨系统为代表的硬组织切磨技术则解决了这一问题。该技术无需脱钙，将不能用常规方法制备成组织切片的特有软硬组织标本制成组织切片，并保持组织本身原有的组织形态[5]。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验组织 人龋齿

1.1.2 仪器 德国EXAKT 组织切磨系统：组织切片机 组织磨片机 载片真空吸附装置 光固化包埋机 组织脱水浸润仪 数显千分尺等。

1.2 方法

将龋齿清洗干净后置于多聚甲醛溶液固定48 小时，流水冲洗过夜，经过酒精上行脱水和光固化树脂浸润，光聚合法包埋成树脂包埋块，利用EXAKT 硬组织切磨系统将包埋块进行切片并打磨至50μm 的薄片，经过甲苯胺蓝染色后自然干燥，中性树胶封片，光学显微镜下观察组织形态[6]。

甲苯胺蓝染色：铁苏木素AB 液1 ∶1 混合，染色5 min(现用现配)，流水冲洗5min，甲苯胺蓝染色50s，流水冲洗至合适的颜色。

2.结果

不同龋坏程度的牙齿硬组织切片甲苯胺蓝染色结果

切片经过甲苯胺蓝染色后，牙釉质呈浅黄色，牙本质呈蓝色。未龋坏的正常牙齿切片后可见完整的牙釉质和牙本质（图1a），浅龋牙齿可见牙釉质表面发生轻度龋坏（图1b），中龋牙齿可见龋坏已穿透牙釉质发展至牙本质线层（图1c），深龋牙齿可见牙釉质已经缺失，龋坏已经发展至牙本质深层（图1d）。

图1 不同龋坏阶段的龋齿组织切片-甲苯胺蓝染色

3.讨论

常规组织石蜡切片是组织形态学实验中应用较为广泛的一种制片技术，在细胞和软组织的病理学诊断中具有重要的意义[7]。石蜡切片对组织的硬度有要求，牙齿、骨组织等硬组织需要进行脱钙处理，以降低组织的硬度。酸类脱钙剂脱钙速度快，但是对组织的破坏性较大；螯合类脱钙剂乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid EDTA）对组织的破坏性较小，是应用较为广泛的脱钙剂，但是脱钙周期较长，一般为数周至数月[8]。硬组织切片技术作为近年来快速发展的新兴技术，由于其无需脱钙，既缩短了制片周期又保护了组织的完整性，因高效快捷而被迅速推广应用[9-12]。

选取了不同龋坏阶段的龋齿作为制片样本，分别为未发生龋坏的正常牙齿、浅龋牙齿、中龋牙齿和深龋牙齿。利用硬组织切片技术将各个龋齿制作成薄切片，经过甲苯胺蓝染色后在光学显微镜下观察可见龋坏在牙釉质和牙本质发展的程度。硬组织切片技术可在包埋块上连续切片，工艺精准且无需脱钙节省了大量时间。EXAKT 硬组织切磨系统的切割带锯含有金刚石颗粒，磨片用的砂纸含有碳化硅颗粒，可以切割硬度较高及含有植入物的组织块，比如含有金属种植钉的骨组织、含有支架的血管肌肉组织等，切片厚度均一，划痕少稳定性高，组织结构形态保持完好，染色后颜色均匀，在光学显微镜下和电镜下均可观察，还可用于切割纤维桩等材料。硬组织切片目前开发的染色方法较多，常用的有甲苯胺蓝染色、苏木素-伊红染色、Van-Gieson 染色、Ladewig 染色、Giemsa 染色等，通过颜色、位置、骨界面定量分析等可以观察牙结石、龋病的发生、种植体与骨组织的结合、新骨生成、血管炎症反应等。

硬组织切片技术应用广泛，但制作含有特殊材料种植体骨组织切片时仍有困难，比如氧化锆陶瓷种植体。氧化锆陶瓷硬度极高，如果种植体是结晶颗粒粘合而成，质地比较疏松，配套的砂纸可以将其打磨变薄，但相比其它种植体需打磨更长时间；如果种植体是整块结晶制成，则需借助特殊研磨料才能将其打磨变薄，耗费大量时间且容易破坏骨结合，影响结果分析。硬组织切片的免疫组化技术是另一个亟待解决的难关。免疫组织化学技术是根据免疫学的基本原理-抗原抗体反应来确定组织细胞内的抗原，对其进行定位、定性、定量的技术。原有的包埋剂7200 将组织块进行包埋后，组织细胞内的抗原信号因化学反应被破坏，无法进行抗原抗体反应，现在已有升级版的包埋剂9100 可以解决这一问题，包埋剂9100 不会破坏遮盖抗原信号，为后期的抗原抗体反应提供条件。切片在进行免疫组化反应之前需进行脱塑处理，使抗原抗体充分接触反应，但是现行的脱塑方法极易导致脱片，脱片后组织皱缩变形，原有的形态结构发生变化，植入物与组织极易分离，无法弥补。为解决这一问题，硬组织切片技术在积极改进脱塑技术以减少脱片概率，或者改良制片方法，使切片不用脱塑直接进行免疫组化反应。如果能克服这一难关，硬组织切片技术必将迈进一大步，在组织工程研究领域作出更大的贡献。

综上所述，EXAKT 硬组织切磨技术无需脱钙，可以将不同龋坏程度的龋齿制成组织薄切片，片子厚度均一，经过抛光工艺划痕少稳定性高，经过染色后在光学显微镜下可以清晰的看到龋坏在牙釉质和牙本质中的发展程度，在龋坏观察等口腔组织工程研究领域有广泛的应用前景。