1株猪源摩氏摩根菌的分离及鉴定

陈培培，齐 心，张 灿

(青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109)

摩氏摩根菌(Morganellamorganii)又称摩根菌，革兰阴性短杆菌，属于肠杆菌科摩氏摩根菌属，广泛存在于自然环境中，是一种条件致病菌，也是一种人兽共患病原菌[1]。摩根菌在动物体抵抗力下降或者在肠道定植为优势菌群条件下，能够引起人与动物的各种感染，如泌尿道感染、伤口感染、肺部感染等，食用污染摩氏摩根菌的肉制品与海产品等可导致食物中毒[2-3]。柯浩珍等[4]报道摩根菌引起病人阴囊感染；王磊等[5]报道摩根菌引起野生的黑格尔七彩神仙鱼皮肤溃烂甚至死亡。作者从猪小肠内容物分离到1株疑似致病菌，通过培养特性、16S rDNA测序及同源性分析，确定其为摩氏摩根菌。通过动物回归试验检测其致病性，同时进行药敏试验筛选其敏感药物，旨在丰富该病原感染动物的种类，同时为防治摩根菌引起的感染提供用药依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 营养琼脂、S.S.琼脂、麦康凯琼脂、LB肉汤和革兰染色液，均购自海博生物技术有限公司；19种药敏纸片(新霉素、头孢噻肟、恩诺沙星、氟苯尼考、氨苄西林、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢曲松、盐酸沙拉沙星、硫胺二甲嘧啶、单硫卡、多西环素、庆大霉素、诺氟沙星、红霉素、链霉素、亚胺培南、美罗培南和氨曲南)，均购自杭州天和微生物试剂有限公司；PCR相关试剂，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 实验动物 4周龄昆明系小鼠18只，购自青岛大任富城畜牧有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离与纯化 无菌条件下取猪小肠内容物，分别划线接种于营养琼脂平板、S.S.琼脂平板和麦康凯琼脂平板，37 ℃培养24 h，再挑取菌落形态特征明显的单菌落，划线传代培养，纯化4代以上，革兰染色后镜检。

1.3.2 16S rDNA 扩增和测序 以菌液为模板，根据廖中华等[6]报道的通用引物进行16S rDNA的PCR。引物序列为：16S-F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；16S-R：5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，预期扩增的目的片段大小为1 406 bp。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.3.3 同源性分析 将16S rDNA测序结果提交到GenBank中进行序列同源性比对，选择同源性较高的13条序列，通过MEGA 7.0 软件用Neighbor-Joining方法(默认参数)绘制进化树，并进行同源性分析。

1.3.4 动物回归试验 将分离纯化的细菌接种到LB液体培养基，37 ℃震荡培养24 h至菌液浓度为1.0×1010CFU/mL。18只昆明系小鼠随机分为3组：空白组、腹腔注射组和灌胃组，每组6只。空白组每只腹腔注射LB肉汤0.5 mL，腹腔注射组每只小鼠注射菌液0.5 mL，灌胃组每只小鼠灌胃菌液0.5 mL，观察小鼠临床症状及死亡情况，记录结果。

1.3.5 药敏试验 参照徐强等[7]所用的纸片扩散法对19种药物进行敏感性检测。用棉签将菌液均匀涂布于营养琼脂平板，待培养基完全吸收菌液后，将各药敏纸片贴于培养基表面适当的位置，37 ℃ 培养24 h，测量抑菌圈直径(mm)，参照EUCAST欧盟药敏试验(2016年)[8]介绍的标准进行结果判定。

2 结果

2.1 细菌的分离及形态学特征 分离菌株在营养琼脂平板上生长状况良好，37 ℃培养24 h后，形成圆润、光滑、边缘整齐、不透明的乳白色菌落。在S.S.琼脂平板上形成透明的小菌落，在麦康凯琼脂平板上形成圆润、不透明的粉红色菌落。染色镜检结果为粉红色、单个或成对排列，两端钝圆的短杆菌，因此判定为革兰阴性杆菌(见中插彩版图1)。

2.2 药敏试验 以19种常规抗生素对分离菌株进行药物敏感性试验，结果见表1。由表1可知，分离菌株对头孢噻肟、左氧氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考、盐酸沙拉沙星、链霉素、庆大霉素、亚胺培南、美罗培南和氨曲南10种抗生素表现为敏感，氨苄西林、头孢曲松、新霉素、单硫卡4种抗生素表现为中度敏感，恩诺沙星、磺胺二甲嘧啶、红霉素、多西环素和诺氟沙星5种抗生素表现为耐受。

表1 分离菌株药敏试验Table 1 Drug sensitivity test of isolated strain

2.3 16S rDNA 的PCR 扩增 以菌液为模板，进行16S rDNA 的PCR 扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。由图2可知，扩增得到与预期片段大小一致的目的片段，大小为1 406 bp。

图2 分离菌株的16S rDNA 琼脂糖凝胶电泳结果Fig.2 16S rDNA agarose gel electrophoresis results of isolated strainsM:DL-2 000 Marker;1～2:分离菌株;3.阴性对照M:DL-2 000 Marker;1～2:Isolated strain;3:Negative control

2.4 同源性分析 16S rDNA测序结果在GenBank中进行同源性比对，结果表明，该菌株为摩根菌，菌株序列提交到GenBank，登录号为MK361125。用Neighbor-Joining方法对该序列及其同源性较高的其他13条序列进行同源性分析，绘制进化树，结果见图3。由图3可知，分离菌株QX01与其余菌株有很高的同源性，均在97%以上。这些菌株分别来源于印度、中国、日本、比利时、加拿大和尼日利亚，说明摩根菌在自然界中广泛分布。

2.5 动物回归试验 分离菌株分别通过腹腔注射和灌胃途径接种昆明系小鼠，检测其致病性。回归试验结果显示，空白组小鼠正常，未出现发病和死亡；腹腔注射组在注射10 h后全部死亡；灌胃组在1周内全部死亡。剖检发现,腹腔注射组和灌胃组死亡小鼠肝脏和肺脏有不同程度地充血、出血现象(见中插彩版图4)，病变的肝脏及肺脏在营养琼脂平板、S.S.琼脂平板和麦康凯琼脂平板上进行划线培养，分离到相同形态的菌落。

图3 同源性分析Fig.3 Homology analysis▲：本试验所分离菌株▲：Strain isolated in this test

3 讨论

摩根菌是一种人兽共患病原菌，致病性强且感染范围广泛，能够引起人和动物的肺炎、尿道炎、关节炎等病症[9-10]。据报道多种水产动物对摩根菌均易感。杨移斌等[11]从患病乌鳢肝、肾、脾及溃烂皮肤肌肉等组织器官分离到摩根菌；韦阳道等[12]从患病胡子鲶脾脏中分离到强致病性的摩根菌。同时，摩根菌也是重要的医院内条件致病菌。谭家余等[13]报道了泌尿系统感染摩根菌，可导致感染性休克和多功能器官损伤；朱永琪等[9]报道摩根菌引起1名顺产后产妇重症感染的病例。家畜感染摩根菌发病病例报告较少。本实验室从猪的小肠内容物中分离到菌株，经16S rDNA测序及同源性分析鉴定为摩根菌。据笔者所知，这是国内首次分离到的猪源摩根菌。该菌以不同的途径感染昆明系小鼠，通过腹腔注射和消化道途径均能导致小鼠内脏器官不同程度的出血肿胀等病变，说明分离株QX01具有较强致病性。廖中华等[6]从山羊中分离到的摩根菌腹腔注射途径能引起感染，但是消化道途径不能引起感染，说明不同的摩根菌菌株致病性存在差异。目前该菌的感染机制和致病机理尚不明确，需要进一步研究。

本试验对该菌进行了19种药物的敏感性检测。已有报道表明，摩根菌对多种常用抗生素具有耐受性。李雪峰等[14]报道该菌对氨苄西林、氟苯尼考和复方新诺明等耐受；兰云等[15]报道利福平、呋喃妥因和头孢噻吩等耐受。本试验中分离到的摩根菌QX01对头孢噻肟等14种药物敏感或中度敏感，对恩诺沙星、磺胺二甲嘧啶、红霉素、多西环素和诺氟沙星5种药物耐受，这与之前报道存在差异，说明不同地区分离到的摩根菌菌株对药物的敏感性各不相同，受当地抗生素使用情况影响，提示养殖户在养殖过程中要慎重、合理用药。

本次试验首次从猪的小肠内容物中分离到具有致病性的摩根菌，当猪只抵抗力下降时，可能引起猪只感染，造成经济损失，其潜在危害应引起养殖户的重视。