机动车尾气诱导大鼠血管内皮损伤模型

陈燕虹，方章福，蔡海荣，庄杰钦，赵子聪，郭永宁，金子淋，张浩波，赵 帅，陈伯钧

(1.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510405；2.广州医科大学附属第一医院，广东 广州 510120；3.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510006)

随着工业革命、城镇化进程加速和汽车交通工具的普行，空气污染越来越严重。近年来，空气污染对人体健康的影响越来越受到关注，研究表明，接触细颗粒物空气污染(空气动力学直径≤2.5 m，PM2.5)会增加冠心病等心血管疾病的风险。内皮损伤是冠心病等动脉粥样硬化性心血管疾病的始动环节和病理基础。有研究表明，内皮损伤在一定程度上和PM2.5暴露相关[1]。但是目前关于空气污染诱发血管内皮功能损伤的模型较少。因此，本试验通过观察机车尾气制造空气污染对大鼠血脂、内皮功能、内皮舒张功能和主动脉病理变化，探讨机动车尾气诱导大鼠血管内皮损伤模型建立的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 健康雄性SPF级SD大鼠，20只，6～7周龄，体重160～180 g，购自广东省医学实验动物中心[许可证号：SCXK(粤)2013-0002]，饲养于广州医科大学[许可证号：SYXK(粤)2015-0104]。大鼠一氧化氮(Nitric oxide，NO)试剂盒，购自北京百奥莱博科技有限公司(批号：SNM195-YQW)；内皮素(Endothelin-1,ET-1)试剂盒，购自南京金益柏生物科技有限公司(批号：JEB-13905);氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL) ELISA试剂盒，购自北京绿源伯德生物科技有限公司(批号：DG20862D)。全自动生化分析仪，购自日本东芝公司；YKY-800显微镜，购自上海永科光学仪器有限公司；TD5B离心机，购自江苏省盐城市凯特实验仪器有限公司；RM6240B型多道生理生物信号采集器、JZJ01型张力换能器，购自四川成都仪器厂。

1.2 动物分组和模型建立 20只大鼠给予普通饲料适应性喂养1周后，随机分为对照组和模型组，每组各10只，每只分笼喂养。对照组大鼠置于普通的SPF级动物房，呼吸新鲜空气。模型组大鼠置于机车尾气暴露房，关闭暴露房，打开开关，拧动摩托车引擎5 min，关闭开关，暴露6 h后搬出动物，置于普通SPF级动物房。暴露期间，摩托车尾气的浓度为1 mg/m3,每周5 d，连续干预8周。造模期间所有大鼠均自由饮水和进食。

1.3 血脂及NO、ET-1水平测定 造模8周后，大鼠禁食不禁饮12 h，腹腔麻醉后经腹主动脉采血10 mL，3 000 r/min离心15 min，取上层血清，-80 ℃ 保存备用。全自动生化分析仪测定总胆固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯 (Triglyceride cholesterol,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的水平。硝酸还原酶法检测NO水平。放免法检测ET-1水平。ELISA法检测ox-LDL水平。具体方法严格按试剂盒说明书进行。

1.4 组织H.E.染色病理学观察 开胸取主动脉约2 cm，4%多聚甲醛固定24 h，经自来水冲洗，酒精行梯度脱水，用石蜡包埋,制成4 μm切片，用二甲苯脱蜡，再进行H.E.染色。染色后用光镜定位于血管内膜观察。

1.5 主动脉内皮功能测定 取一部分胸主动脉置于Krebs-Henseleit液中，剪成3 mm的血管环，连接多道生理生物信号采集器及张力换能器后，调整静息张力2 g，再给予KCl预刺激2次，再给予去甲肾上腺素预收缩血管，稳定后给予浓度梯度的乙酰胆碱(Acetylcholine，Ach)(内皮依赖性血管舒张反应)和硝普钠(Sodium nitroprusside，SNP)(内皮非依赖性血管舒张反应)诱导血管舒张反应，同步记录血管张力的变化。

2 结果

2.1 各组大鼠血脂水平的比较 与对照组比较，模型组大鼠血清TC、TG、LDL、ox-LDL明显升高(P<0.05)，而HDL明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血脂水平的比较Table 1 Comparison of blood lipid levels in each group of rats

2.2 各组大鼠NO、ET-1的比较 与对照组比较，模型组大鼠血清NO明显降低(P<0.05)，ET-1明显升高(P<0.05)。见表2。

2.3 各组大鼠血管内皮依赖性舒张功能比较 与对照组比较，模型组大鼠由Ach介导的内皮依赖性舒张程度明显降低(P<0.05)。见表3。

表2 各组大鼠NO、ET-1的比较Table 2 Comparison of NO and ET-1 levels in each group of rats

2.4 各组大鼠血管内皮非依赖性血管舒张功能比较 与对照组比较，模型组大鼠由SNP介导的内皮非依赖性舒张程度差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.5 各组大鼠胸主动脉病理变化 对照组大鼠胸主动脉可见血管内膜无增厚，内皮细胞排列较整齐，大小较一致(中插彩版图1A)；模型组大鼠胸主动脉血管内膜增厚，突向管腔，内皮细胞排列紊乱，可见较多嗜中性粒细胞(中插彩版图1B)。

表3 各组大鼠血管内皮依赖性舒张功能比较Table 3 Comparison of the vascular endothelial-dependent diastolic function in each group of rats

表4 各组大鼠血管内皮非依赖性舒张功能比较Table 4 Comparison of the vascular endothelium-independent diastolic function in each group of rats

3 讨论

随着社会的进步和生活方式的改变，动脉粥样硬化性心血管疾病发病率越来越高，并且呈现年轻化的趋势。Zhao X等[2]研究发现，空气污染同样与心血管疾病密切相关，是动脉粥样硬化性心血管疾病的重要致病因素。血管内皮功能损伤是冠心病等动脉粥样硬化性心血管疾病的重要始动环节。血管内皮不仅是血液和血管之间的重要屏障,而且是代谢内分泌器官,可以释放多种血管活性物质,包括NO、ET-1等,在调节血管张力等方面有重要作用[3-5]。内皮损伤指是指NO和ET-1失衡引起的内皮依赖性血管舒张功能受损[6-7]。NO可通过激活钙-钠离子通道活性、抑制血管平滑肌细胞增生和迁移、抑制内皮素等缩血管物质分泌、抑制粘附因子的表达及血小板的凝聚等途径预防血栓形成。ET是目前已知的最强的收缩血管因子，在人VEC主要分布的是ET-1，有强大的缩血管作用[8-9]。因此NO分泌减少或活性降低或ET-1增加均可提示血管内皮损伤。

血管内皮损伤与脂质密切相关，血液中增加的LDL可损伤血管内膜，使内皮细胞特性发生改变，使单核细胞对血管内皮的粘附力增加，增加其粘附在内皮细胞的数量，通过趋化在内皮细胞间迁移，进入内膜后单核细胞转化成巨噬细胞，巨噬细胞通过清道夫受体吞噬大量脂质，主要为内皮下大量沉积的ox-LDL。ox-LDL可以通过激活血管内皮细胞特异性受体,上调相关基因及蛋白表达,抑制NO和促进ET-1的生成,诱导血管舒缩功能障碍,促进内皮细胞表面粘附分子和细胞因子的生成来损伤内皮功能。ox-LDL还对内皮细胞有毒性作用，巨噬细胞在内膜下的积聚导致内膜进一步改变[10-11]。而乙酰胆碱引起的血管内皮依赖性舒张主要由一氧化氮，前列环素和内皮来源的超极化因子调节，其中NO是最主要的内皮依赖性舒张因子之一。

长期暴露于PM2.5环境中会导致内皮功能障碍，从而加速动脉粥样硬化等心血管疾病的发展。近年来有研究结果显示，PM2.5可能引起心血管内皮细胞损伤[12-13]。Naghavi M等[14-15]证实，PM2.5可以通过内皮功能受损等途径影响血管的弹性和管径的变化。赵金镯等[16]观察大气PM2.5对大鼠心血管系统的急性作用,结果显示,心电图缺血改变,心脏自主节律功能降低,血压和心肌酶学升高,且呈剂量-反应关系。因此，PM2.5可能通过内皮损伤进而导致心血管疾病的发生发展。但是目前关于空气污染致内皮损伤的模型尚不成熟。本试验通过机动车尾气诱导空气污染大鼠，结果发现，模型组大鼠TC、TG、LDL、ox-LDL、ET-1明显升高，而NO、对Ach内皮依赖性舒张功能和HDL含量降低，胸主动脉内皮细胞排列紊乱。提示机车尾气可引起内皮功能障碍，诱导大鼠内皮损伤模型。