2016-2018年辽宁部分地区猪场猪链球菌2型流行病学及大环内酯类耐药基因携带情况调查

刘耀川，高 锋，郭首龙，李 旭，关 淼，周 维，杨洺扬，申贯男

(1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164；2.辽宁农业职业技术学院，辽宁 营口 115009)

猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一类猪群中正常携带的人兽共患病原微生物[1]，常见于健康猪的生殖道、消化道及上呼吸道中[2]。S.suis可引起包括猪心内膜炎、脑膜炎、关节炎及人脑膜炎在内的一系列化脓性炎症[3]。猪链球菌血清型众多，2型仍然是主要致病血清型，此外9型、7型、5型、CHz血清型和部分未定型菌株致病呈上升趋势。迄今，感染人的血清型增至9种，有2型、5型、9型、14型、16型、21型、24型和31型[4-6]。其中猪链球菌2型(Streptococcussuistype 2,SS2)是目前流行范围最广、致病性最强的血清型[7]。我国及世界范围内已有多起因SS2引起的猪群及人感染并死亡的报道，给生猪养殖业及公共卫生安全造成严重威胁。大环内酯类抗生素为临床上治疗SS2感染的主要手段之一[8]。但在药物选择压力的作用下耐药菌株不断出现，给人类安全及公共卫生造成挑战。本试验于2016-2018年，对辽宁地区14个市的19个规模化生猪养殖场开展为期3年的SS2流行病学调查，并对分离到的SS2分离株进行大环内酯类药物耐药基因筛查，为辽宁地区SS2大环内酯类药物耐药性分子机制研究及SS2综合防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2016-2018年于辽宁省14个市选取规模化生猪养殖场19个，对患败血症、关节肿大、呼吸困难、脑炎的病死猪进行样品采集。

1.1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆琼脂(Tryptic soy agar，TSA)固体培养基，购自北京奥博星生物技术责任有限公司；2×TaqPCR Master Mix，购自北京全式金生物技术有限公司；pMD20-T vector克隆载体、DL-2 000 DNA Marker，均购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)；细菌基因组DNA提取试剂盒和DNA凝胶回收纯化试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 主要仪器 梯度PCR扩增仪(T100 Thermal Cycler，BIO-RAD)、数码凝胶成像系统(Gel Dox XR+，BIO-RAD)、低温高速台式离心机(Biofuge Primo R，Thermo Fisher)、立式高压灭菌器(SX700，TOMY)等仪器，均由辽宁省动物疫病预防控制中心提供。

1.1.4 引物 根据NCBI中已公布的S.suis16S rRNA基因序列、SS2分型基因cps2J序列及大环内酯类药物耐药基因ermA、ermB、ermC及mefA序列，使用Primer 5.0设计特异性引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具体引物信息见表1。

表1 SS2筛查、定型及大环内酯类药物耐药基因检测引物信息Table 1 Primers information of SS2 screening,typing and macrolide drug resistance gene detection

1.2 方法

1.2.1 样品采集 无菌采集关节液、脑、心、肺等组织块，于4 ℃无菌离心管中保存，并尽快送至辽宁省动物疫病预防控制中心。

1.2.2 病原菌分离 按说明书要求无菌制备含10%脱纤维兔血的TSA固体培养基，待其凝固后于37 ℃过夜检菌。在洁净工作台中，用镊子取采样组织块，或用无菌棉拭子蘸取关节液，并均匀涂布于检菌合格的TSA血平板中，于37 ℃倒置培养18 h。挑取灰白色且有溶血环的单独小菌落于5 mL无菌营养肉汤中，37 ℃ 180 r/min振荡培养12 h。于同一病例不同组织中分离到的菌株，作为1个分离株进行统计。

1.2.3 基因组DNA提取及S.suis分离株鉴定 按基因组DNA提取试剂盒说明书操作要求，提取初步分离的S.suis分离株基因组DNA，并以其为模板对16S rRNA进行PCR扩增。产物经1%琼脂糖凝胶电泳后回收，并与pMD20-T vector克隆载体连接，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。经BLAST序列比对后，确定S.suis分离株。PCR反应体系：2×TaqPCR Master Mix 25 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 22 μL，体系总体积50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性40 s,可变退火温度30 s,72 ℃延伸45 s～1 min，重复35个循环；72 ℃最终延伸7 min；4 ℃保存。

1.2.4 SS2 PCR鉴定 使用SS2定型引物，以S.suis分离株基因组DNA为模板，对SS2进行PCR鉴定。PCR反应体系及条件同1.2.3。扩增产物经测序、比对后，最终确定SS2分离株。

1.2.5 大环内酯类药物耐药基因筛查 以SS2分离株基因组DNA为模板，对其大环内酯类药物耐药基因携带情况进行PCR筛查。具体方法同1.2.3。

2 结果

2.1S.suis初步分离及SS2鉴定结果

2.1.1 样品采集及S.suis初步分离 2016-2018年课题组于受试养殖场共采集发病猪、死猪样品2 251份(2016-2018年分别为792份、626份和833份)。样品经TSA血液培养基培养，初步分离S.suis分离株1 851株(2016-2018年分别为622株、537株和692株)。

2.1.2S.suis分离株16S rRNA鉴定 以初步分离的S.suis分离株基因组DNA为模板，对其16S rRNA进行扩增。经序列测定及比对，确定S.suis分离株1 159株(2016-2018年分别为391株、306株和462株)，其样品分离率为51.5%(1 159/2 251)。2016-2018年分离率分别为49.4%(391/792)、48.9%(306/626)和55.5%(462/833)。部分S.suis分离株16S rRNA PCR扩增结果见图1。

图1 部分S.suis分离株16S rRNA电泳结果Fig.1 The electrophoresis results of 16S rRNA obtained from S.suisM:DL-2 000 DNA Marker；1～6:S.suis分离株M:DL-2 000 DNA Marker；1～6:S.suis isolates

2.1.3 SS2分离株分型鉴定 以经序列比对确定为S.suis分离株的基因组DNA为模板，利用特异性引物对SS2分型基因cps2J进行PCR扩增，经测序、比对确定SS2分离株451株(2016-2018年分别为152株、106株和193株)。SS2在S.suis分离株中占比及样品分离率分别为38.9%(451/1 159)和20.0%(451/2 251),2016-2018年占比及样品分离率分别为38.9%(152/391)、19.2%(152/792)；34.6%(106/306)、16.9%(106/626)；41.8%(193/462)和23.2%(193/833)。部分cps2J基因PCR扩增结果见图2。

图2 部分SS2分型基因cps 2J电泳结果Fig.2 The electrophoresis results of cps 2J gene obtained from SS2M:DL-2 000 DNA Marker；1～4:cps2J基因M:DL-2 000 DNA Marker；1～4:cps2J gene

2.2 大环内酯类药物耐药基因筛查结果

2.2.1 分离株耐药基因携带情况 在451株SS2分离株中，共有255株携带不同类型的大环内酯类药物耐药基因，菌株阳性率为56.5%(255/451)。其中234株为仅携带1种耐药基因的菌株，占比51.9%(234/451)；21株分离株同时携带2种耐药基因，占比4.7%(21/451)；未发现同时携带3种及3种以上耐药基因的分离株。

共有87株分离株仅携带ermA基因，占比19.3%(87/451)；66株分离株仅携带ermB基因，占比14.6%(66/451)；81株分离株仅携带mefA基因，占比18.0%(81/451)；16株分离株同时携带ermA和mefA基因，占比3.5%(16/451)；5株分离株同时携带ermB和mefA基因，占比1.1%(5/451)。

2.2.2 耐药基因筛查 筛查共获得大环内酯类耐药基因276个，其中ermA、ermB和mefA基因占比分别为37.3%(103/276)、25.7%(71/276)和37.0%(102/276)，未检测到ermC基因。

按年份分析ermA、ermB和mefA基因筛查结果，2016年上述3种基因的占比分别为41.2%(42/102)、22.5%(23/102)和36.3%(37/102)；2017年为33.6%(27/80)、23.8%(19/80)和42.5%(34/80)；2018年为36.2%(31/94)、30.9%(29/94)和33.0%(31/94)。具体耐药基因筛查结果见表2。部分耐药基因PCR扩增结果见图3。

表2 耐药基因筛查结果Table 2 The screening results of drug resistance gene

图3 部分大环内酯类药物耐药基因电泳结果Fig.3 The electrophoresis results of some macrolides resistance geneM:DL-2 000 DNA Marker；1～2:ermA基因；3～4:ermB基因；5～6:mefA基因M:DL-2 000 DNA Marker；1～2:ermA gene；3～4:ermB gene；5～6:mefA gene

3 讨论

目前SS2是世界范围内主要流行的血清型，作为健康猪的常在病原菌，其对生猪养殖业及从业人员的健康造成严重威胁。近年来，已有多例人感染SS2引起死亡的病例报道，SS2已成为重要的公共卫生安全隐患[9-11]。本试验对辽宁地区19个规模化生猪养殖场进行3年的SS2流行病学调查，结果表明，SS2占总分离S.suis的38.9%。近期报道中，该分离率为10.0%～53.3%不等。如徐引弟等[7]于2016年对河南地区调查发现，SS2占总S.suis分离株的46.0%；赵战勤等[5]于2011-2015年对河南及周边省份进行调查发现，SS2占总S.suis分离株的53.3%；刘琪等[12]广东地区调查发现，SS2占比为16.58%；王娟等[9]在广州地区健康猪群中调查发现，S.suis携带率为33.81%，其中SS2占比8.82%；徐魁等[8]对四川地区SS2进行流行病学调查，结果表明，四川地区SS2总体阳性率为40.3%，81.8%的受调查规模化养殖场均为SS2阳性；杨春蕾等[13]在天津地区调查发现，SS2的样品阳性率为3.5%；董志民等[14]对我国多地区流行病学调查发现，SS2占比为24.4%。本试验结果与报道数据相比，在样品分离率及在总S.suis分离株中占比均属于相对较高水平，表明辽宁地区规模化生猪养殖场中SS2流行情况相对较高。

本试验对451株SS2分离株4种大环内酯类药物耐药基因携带情况进行筛查，结果表明，共有103株(87株仅携带ermA基因及16株同时携带ermA、mefA基因)为ermA基因阳性株，占比22.8%(103/451)；71株(66株仅携带ermB基因及5株同时携带ermB、mefA基因)为ermB基因阳性株，占比15.7%(71/451)；102株(81株仅携带mefA基因及21株同时携带2种耐药基因)为mefA阳性株，占比22.6%(102/451)，未检出ermC基因。孙佳楠等[15]报道，在辽宁西部猪源SS2中，ermA、ermB、ermC和mefA基因的检出率分别为53.3%、76.1%、0%和5.43%；芮萍等[16]报道，河北地区猪源SS2ermB、ermA检出率分别为98.0%和25.5%，未检出mefA基因；黄金虎等[11]对江苏、江西等地调查发现，其ermB、mefA基因阳性率分别为26.1%和8.7%。与报道数据比较，受试饲养场SS2分离株在耐药基因种类及阳性率方面均有所不同，可能与地区间用药习惯、治疗方案不同有关，同时不同地区病原菌间耐药性传递机制差异也可能对耐药基因携带结果存在影响。