叶黄素对人肺癌H1975细胞增殖和转移的抑制作用及Hippo信号通路的影响

杨谦，杨蒙蒙，张军，谭雪敏，马玉泉

肺癌是我国的主要健康问题，约占所有癌症相关死亡人数的28%[1]。肺癌的2种主要形式是小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，分别占15%和85%[2]。常规治疗和手术方法难以控制肺癌，导致预后不良，NSCLC的总体5年生存率仅为15%。显然，有必要对NSCLC的替代治疗方案进行研究，有望减轻这一主要的死亡负担[3]。Hippo通路的失调和肺癌发展有关，并有助于肺癌细胞的发展和转移[4]。钙黏蛋白4(FAT4)可以作为Hippo通路调节剂来抑制癌细胞的生长和侵袭，并且在24%的肺癌患者中发生突变[5]。FAT4是一种肿瘤抑制因子，可诱导细胞死亡，FAT4的抑制导致Yes结合蛋白(YAP)激活，从而诱导YAP靶基因的上调[6]。叶黄素(3,3-二羟基-α-胡萝卜素)又称“植物叶黄素”，是一种氧化的类胡萝卜素，在自然界广泛存在，可以从万寿菊中提取。大量的流行病学证据表明，叶黄素在预防动脉粥样硬化和与年龄有关的黄斑变性，增强免疫系统及作为抗肿瘤药方面具有多种功能[7]。本研究拟探讨叶黄素对人肺癌H1975细胞增殖和转移的抑制作用及Hippo信号通路的影响，为肺癌的治疗提供理论依据，报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要药品、试剂及仪器 (1) 主要药品、试剂:叶黄素(纯度99.95%)、5-氟尿嘧啶(纯度99.99%)(美国sigma公司)；RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)、Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、NP-40裂解缓冲液、结晶紫染液(碧云天生物技术研究所)；Matrigel小室(美国BD公司)；膜联蛋白V-PE凋亡检测试剂盒、核糖核酸酶(RNase)、碘化丙啶(PI)染色液(上海群己生物科技有限公司)；逆转录试剂盒(PrimeScriptTM RT)(宝日医生物技术北京有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(赛默飞世尔科技中国有限公司)；聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、硝酸纤维素膜(德国默克公司)；FAT4、YAP、β-actin一抗(美国Abcam公司)；HRP标记山羊抗兔IgG二抗(上海研卉生物科技有限公司)；SuperSignal West Pico化学发光底物试验试剂盒(美国Pierce公司)。(2)主要仪器：UV1901型紫外分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)；IX71型倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)；FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD公司)；ABI 7900HT型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 细胞培养及分组 实验于2019年8—9月在邯郸市中心医院实验室进行。人肺癌H1975细胞系购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，批号S2019061703。将细胞置于10%FBS和1%青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基中培养，培养环境为37℃、5%CO2、2% O2、93%N2。分组设计：H1975细胞组，将H1975细胞在含有10% FBS的RPMI-1640培养基中培养，培养环境为37℃、5%CO2、2% O2、93%N2；5-氟尿嘧啶组，H1975细胞培养方法同H1975细胞组，加入5-氟尿嘧啶，使5-氟尿嘧啶剂量为100.0 μg/ml(预试验求得5-氟尿嘧啶对H1975细胞的LC50为200.0 μg/ml，以1/2 LC50为作用剂量)；叶黄素低、高剂量组的H1975细胞培养方法同H1975细胞组，各组分别加入叶黄素，使叶黄素剂量为100.0 μg/ml、200.0 μg/ml(预试验求得叶黄素对H1975细胞的LC50为400.0μg/ml，以1/4、1/2 LC50为低、高剂量)。以上各组每孔设6个平行样，培养72 h。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 细胞存活率及克隆形成数目测定：使用CCK-8试剂评估细胞存活率。将细胞以1×103个/孔的密度接种到96孔板的100 μl培养基中，将100 μl CCK-8试剂添加到培养物中。然后用紫外分光光度计在450 nm下测量OD值。细胞存活率=实验组OD/空白组OD×100%。空白组为蒸馏水调零组。

将细胞以800个/孔的浓度接种到6孔板中72 h。然后，每3天用含有10%FBS的培养基更新培养基一次，观察到单克隆形成。计数具有40个以上细胞的单克隆，应用结晶紫染色，并使用显微镜拍摄代表性照片。

1.3.2 细胞侵袭、转移水平测定：进行Matrigel小室侵袭测定，将1×104个细胞添加到包被Matrigel小室(孔径为8 μm微孔)的上腔室中。将含有10%FBS的600 μl培养基添加到下腔室中。固定细胞并在72 h后分别用0.05%的结晶紫染色。使用显微镜以200倍放大率拍摄每个腔室的6个随机视野。

1.3.3 细胞凋亡水平测定：使用膜联蛋白V-PE凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。收获预处理的细胞，在4℃的冰冷70%乙醇中固定过夜，然后重悬于1 ml含1 mg/ml RNase和50 μg/ml PI的磷酸缓冲液，并在暗盒中于室温放置30 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。通过计数右上象限Annexin-V阳性—PI阳性细胞的比例，即为凋亡率。

1.3.4 细胞FAT4、YAP基因表达测定：通过Trizol试剂从细胞中提取总RNA。RNA的纯度和浓度通过紫外分光光度计测量。用PrimeScriptTM RT试剂盒进行逆转录。反应条件为37℃ 15 min逆转录，85℃ 5 s逆转录酶灭活。获得的cDNA在-80℃保存。引物由宝日医生物技术北京有限公司合成，序列如下，FAT4正向：5′-CTGTGAGTACCTGTGACTGGTGTGACCCTGT-3′，反向：5'-GTGTCTGTGTGGAVCTGAAGTGAC-3'；YAP正向：5'-CTGTGACTACCCGTCTGCCTGTGA-3'，反向：5'-CTGTGACTGCGGCGAGTGCTGA-3'；β-actin正向：5'-CTGTGACTGACCGTCTACTGTGAC-3'，反向：5'-CCGTGTGACGTCGGCGACGTGTGAC-3'。β-actin作为内参基因。在ABI 7900HT型荧光定量PCR仪进行PCR反应。反应条件如下：在95℃预变性30 s，在95℃下变性40 s，在58℃下退火30 s。通过2-ΔΔCt方法计算mRNA相对表达量。

1.3.5 细胞FAT4、YAP蛋白水平测定：NP-40裂解缓冲液提取总蛋白，并通过BCA蛋白浓度测定试剂盒进行定量。用12%SDS-PAGE电泳分离出每个样品中的蛋白质(50 μg)，并将其电印迹到硝酸纤维素膜上。在室温下用5%牛奶封闭1 h后，将膜与FAT4(1∶2 000稀释)、YAP(1∶2 000稀释)、β-actin(1∶2 000稀释)一抗、HRP标记山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀释)在4℃孵育过夜。使用Super Signal West Pico化学发光底物试验试剂盒可视化标记有抗体的蛋白条带。使用Chemi Doc XRS系统获取图像，使用Band Scan 5.0版软件分析蛋白质表达。

2 结 果

2.1 各组肺癌H1975细胞OD值、存活率比较 与H1975细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及叶黄素低、高剂量组OD值、存活率均降低(P<0.05)；与5-氟尿嘧啶组比较，叶黄素低、高剂量组OD值、存活率升高(P<0.05)；与叶黄素低剂量组比较，叶黄素高剂量组OD值、存活率降低(P<0.05)，见表1。

2.2 各组肺癌H1975细胞克隆形成数目比较 与H1975细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及叶黄素低、高剂量组克隆形成数目降低(P<0.05)；与5-氟尿嘧啶组比较，叶黄素低、高剂量组克隆形成数目升高(P<0.05)；与叶黄素低剂量组比较，叶黄素高剂量组克隆形成数目降低(P<0.05)，见表2、图1。

表1 各组肺癌H1975细胞OD值、存活率比较

表2 各组肺癌H1975细胞克隆形成数目比较个)

2.3 各组肺癌H1975细胞穿膜数比较 与H1975细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及叶黄素低、高剂量组穿膜数降低(P<0.05)；与5-氟尿嘧啶组比较，叶黄素低、高剂量组穿膜数升高(P<0.05)；与叶黄素低剂量组比较，叶黄素高剂量组穿膜数降低(P<0.05)，见表3、图2。

表3 各组肺癌H1975细胞穿膜数比较个)

AH1975细胞组 5-氟尿嘧啶组 叶黄素低剂量组 叶黄素高剂量组

H1975细胞组 5-氟尿嘧啶组 叶黄素低剂量组 叶黄素高剂量组

2.4 各组肺癌H1975细胞凋亡率比较 与H1975细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及叶黄素低、高剂量组凋亡率升高(P<0.05)；与5-氟尿嘧啶组比较，叶黄素低、高剂量组凋亡率降低(P<0.05)；与叶黄素低剂量组比较，叶黄素高剂量组凋亡率升高(P<0.05)，见表4。

表4 各组肺癌H1975细胞凋亡率比较

2.5 各组肺癌H1975细胞FAT4、YAP mRNA表达比较 与H1975细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及叶黄素低、高剂量组FAT4 mRNA表达水平升高，YAP mRNA表达水平降低(P<0.05)；与5-氟尿嘧啶组比较，叶黄素低、高剂量组FAT4 mRNA表达水平降低，YAP mRNA表达水平升高(P<0.05)；与叶黄素低剂量组比较，叶黄素高剂量组FAT4 mRNA表达水平升高，YAP mRNA表达水平降低(P<0.05)，见表5。

表5 各组肺癌H1975细胞FAT4、YAP mRNA表达比较

2.6 各组肺癌H1975细胞FAT4、YAP蛋白表达比较 与H1975细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及叶黄素低、高剂量组FAT4 蛋白表达水平升高，YAP蛋白表达水平降低(P<0.05)；与5-氟尿嘧啶组比较，叶黄素低、高剂量组FAT4蛋白表达水平降低，YAP蛋白表达水平升高(P<0.05)；与叶黄素低剂量组比较，叶黄素高剂量组FAT4蛋白表达水平升高，YAP蛋白表达水平降低(P<0.05)，见表6、图3。

表6 各组肺癌H1975细胞FAT4、YAP蛋白表达比较

注：A.H1975细胞组；B.5-氟尿嘧啶组；

3 讨 论

肺癌是全球范围内与癌症相关死亡的主要原因，男性吸烟者的发病率为17.2%，女性吸烟者的发病率为11.6%，而非吸烟者分别为1.3%和1.4%[8]。肺癌以NSCLC为主，包括腺癌、鳞癌、腺鳞癌和大细胞肺癌。尽管在过去的几十年中，人们一直在努力开发针对NSCLC的新疗法，包括化学疗法和分子靶向疗法，但对于转移性NSCLC患者，其5年生存率仍低于5%[9]。叶黄素是一种含氧的类胡萝卜素，在自然界广泛存在。叶黄素存在于许多有色水果(石榴、浆果和深色葡萄)和蔬菜(茄子、西红柿、胡萝卜和红洋葱)中，具有抗氧化剂、抗炎、抗增殖和抗癌活性。叶黄素在炎性反应、心血管疾病、年龄相关性黄斑变性及癌症中的有益作用已被探索[10]。研究已经证明，叶黄素对冠心病患者具有抗炎性反应作用，叶黄素可抑制PDGF和H2O2信号传导，并抑制血管平滑肌细胞的迁移[11]。叶黄素是一种多目标治疗性天然药物，可阻断RTK活性及EGFR、VEGFR2的下游信号传导，以提高治疗癌症效果并将对正常宿主细胞的毒性降至最低[12]。本研究结果显示，与H1975细胞组比较，5-氟尿嘧啶组、叶黄素低剂量组、叶黄素高剂量组OD值、存活率、克隆形成数目、穿膜数均降低，凋亡率升高；与叶黄素低剂量组比较，叶黄素高剂量组OD值、存活率、克隆形成数目、穿膜数降低，凋亡率升高。说明叶黄素能明显抑制人肺癌细胞H1975增殖及转移，且叶黄素高剂量组抑制人肺癌细胞H1975增殖及转移更显著。

Hippo信号通路是一种肿瘤抑制通路，它通过抑制细胞生长和增殖并促进细胞凋亡来调节器官的大小。该途径主要由核心抑制激酶级联反应组成，包括MST1/2和LATS1/2，这些成分会磷酸化转录共激活因子YAP。一旦被激活，YAP就会转移到细胞核中，并与TEAD1-4相互作用以激活Hippo信号通路的下游靶标，从而促进细胞过度生长和转移[13]。FAT4是钙黏着蛋白超家族的钙黏着蛋白相关蛋白，是Hippo信号的调节剂和抑癌剂，可抑制癌细胞的生长[14]。FAT4在肺癌中下调，并在各种人类癌症中反复突变，涉及肝细胞癌和胃癌[15]。FAT4是Hippo生长控制途径的重要组成部分，在39%的肿瘤中被甲基化[16]。FAT1和FAT4通过激活与lamellipodia和filopodia上的肌动蛋白聚合相关的Hippo信号传导来抑制肿瘤生长。FAT4也被指出可诱导YAP易位，YAP易位于胃癌的细胞增殖和迁移[17-19]。本研究结果显示，与H1975细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及叶黄素低、高剂量组FAT4 mRNA和蛋白表达水平升高，YAP mRNA和蛋白表达水平降低；与叶黄素低剂量组比较，叶黄素高剂量组FAT4 mRNA和蛋白表达水平升高，YAP mRNA和蛋白表达水平降低。这与上述讨论一致，同时说明，叶黄素可促进FAT4 mRNA和蛋白的表达，抑制YAP mRNA和蛋白表达进而抑制Hippo通路。近期，许多研究报道了肺癌中Hippo信号的失活与肿瘤的发生和发展有关。这种失活也被证明会导致Hippo通路下游基因如CTGF、CYR61、FOXM1和CDX2的上调，而这些基因是否会在肺癌中改变，将在后续研究中进行证实。

综上所述，叶黄素能明显抑制人肺癌细胞H1975增殖及转移；其机制与叶黄素可促进FAT4 mRNA和蛋白表达、抑制YAP mRNA和蛋白表达进而抑制Hippo通路有关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

杨谦：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；杨蒙蒙：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；张军：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；谭雪敏：进行统计学分析；马玉泉：课题设计，论文撰写