HBx-MALAT-XB130通路对肝癌细胞生长和迁移的影响机制

黄超群，刘微，高文娟，段体龙，王丹丹

肝细胞癌为恶性肿瘤，对患者的生活质量和生命安全造成了严重威胁[1-2]。临床上对肝癌的发病原因尚未完全清楚，但众多学者一致认为其是受多种因素影响的复杂过程[3-4]。肝癌发生早期并没有明显的症状，当被发现时，肝癌已属晚期，耽误了疾病的最佳治疗时机，严重威胁患者的生命安全[5-6]。临床上将上皮组织和间叶组织起源的肝癌称为原发性肝癌，其在我国具有高发性和高危险性[7-8]。现探究HBx-MALAT-XB130通路对肝癌细胞生长和迁移的影响机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)人肝癌细胞株:购于中国医学科学院。(2)药物、试剂：MTT试剂盒(艾美捷科技有限公司)；PBS缓冲液、SSC溶液、多聚甲醛(上海酶联生物科技有限公司)，DAPI染色剂(北京富百科生物技术有限公司)。(3)仪器设备：Transwell小室(上海国药集团化学试剂有限公司)；离心机(杭州川一实验仪器有限公司，型号TG16-WS)、酶标仪(济南欧莱博科学仪器有限公司，型号F50)。

1.2 实验方法 2019年6—10月于解放军联勤保障部队第962医院实验室进行实验，本实验获医院伦理委员会批准。

1.2.1 人肝癌细胞培养：于40℃时对冻存的肝癌细胞进行火浴处理，之后充分摇晃，将混合均匀的肝癌细胞置于培养基[10%PBS、1%双抗(青链霉素)RPMI-1640培养基]2 ml中，之后离心处理，进行重悬处理后将细胞传代，使用CO2培养箱对培养基培养24 h、换液，细胞融合率达90%后传代。

1.2.2 慢病毒载体构建：引物序列根据质粒特点进行引物设计，引入SacⅠ酶切位点(由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)。正反链混合后加入退火缓冲液，96℃反应4 min，室温冷却，生成双链。使用Eco31Ⅰ酶切线性化质粒pGenesil-1，100倍稀释退火产物之后与其连接，20℃下水浴孵育过夜，使用大肠杆菌DH5α转化，第2天选择单克隆菌落，在Kana的LB培养液(30 μg/ml)中接种，离心处理，37℃下震荡混匀，孵育过夜。少量抽提质粒后使用SacⅠ酶切进行鉴定[由宝生物工程(大连)有限公司完成]，分为低阻断组、中阻断组、高阻断组。重悬处理后分别加入DAPT 1 ml、5 ml、10 ml中，电击处理后室温下存放120 min，将各组细胞加入6孔、96孔培养板中，置于培养箱内进行培养，取出后加入含G418的培养基800 μg/ml中再次培养。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 MTT法检测细胞生长能力：将各组细胞加入96孔板中，分别于12、24、48、72 h后在每孔中加入MTT液30 μl，37℃孵育4 h，弃培养液，加入DMSO 150 μl ，酶标仪在498 nm波长处检测每孔的OD值，检测肝癌细胞生长情况。

1.3.2 TUNEL法检测细胞凋亡：常温下使用蛋白酶K 20 μg/ml培养0.5 h后去除蛋白，使用PBS缓冲液进行彻底清洗，加入平衡缓冲液100 μl，室温环境中平衡10 min，然后滴入TdT酶反应液100 μl，避光、室温下孵育1 h，之后加入 SSC溶液100 μl，常温下静置20 min后进行清洗3次，使用DAPI进行复染，避光培养10 min后再次进行浸洗，封片观察。DAPI复染细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈绿色，每张切片取3个视野进行观察，计算细胞凋亡率，取其平均值。

1.3.3 流式细胞仪检测细胞周期：将各组细胞传代至5孔板，并将其置于5% CO2、37℃下培养，添加0.25%胰蛋白酶进行消化，离心处理10 min，使用PBS缓冲液进行清洗，再次离心处理，之后添加PI染液1 ml，置于常温、避光环境60 min，进行特异荧光标记后按照流式细胞仪操作方法检测细胞周期分布。

1.3.4 Transwell小室实验检测细胞侵袭：检测前2 h湿化小室，上室加入细胞悬液200 μl ，在下室加入含10%胎牛血清的细胞培养液，在培养箱中培养24 h。用PBS冲洗2次后置于4%多聚甲醛中30 min。染色后在显微镜下观察计数。

1.3.5 细胞划痕实验检测细胞迁移：使用胰酶消化细胞制成细胞悬液，接种于6孔板。使用10枪尖垂直于孔板底部画直线，PBS缓冲液清洗3次。常温培养24 h拍照计算划痕。

1.3.6 Western-blot法检测Bcl-2、Bax、Caspase3、p53表达：使用PBS缓冲液对标本冲洗之后裂解30 min，测定蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质，添加蛋白缓冲液后进行电泳，10 min后将电转膜置于10%牛奶中浸泡，常温环境下封闭90 min。之后结合一抗、稀释，孵育1 d，取出后使用TBST液冲洗，结合二抗，60 min后清洗、显色，对Bcl-2、Bax、Caspase3、p53相对表达量进行检测。

2 结 果

2.1 各组不同时间点肝癌细胞生长率比较 在24 h、48 h、72 h时进行肝癌细胞生长率比较，低阻断组<中阻断组<高阻断组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 3组不同时间点肝癌细胞生长率比较

2.2 各组不同时间点肝癌细胞凋亡率比较 在24 h、48 h、72 h时进行肝癌细胞凋亡率比较，低阻断组>中阻断组>高阻断组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2。

2.3 各组肝癌细胞侵袭、迁移能力比较 肝癌细胞侵袭和迁移细胞数比较，低阻断组<中阻断组<高阻断组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表3、图1～2。

表2 3组不同时间点肝癌细胞凋亡率比较

表3 3组肝癌细胞侵袭、迁移能力比较个)

2.4 各组肝癌细胞周期分布比较 G1、S、G2期肝癌细胞比例比较，低阻断组<中阻断组<高阻断组，差异均有统计学意义 (P<0.01)，见表4。

表4 3组肝癌细胞周期分布比较

图1 3组肝癌细胞侵袭情况(结晶紫染色，×100)

图2 3组肝癌细胞迁移情况(Giemsa 染色，×100)

2.5 各组Bcl-2、Bax、Caspase3、p53相对表达量比较 Bcl-2相对表达量比较，低阻断组>中阻断组>高阻断组， Bax、Caspase3、p53相对表达量比较，低阻断组<中阻断组<高阻断组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表5。

表5 3组Bcl-2、Bax、Caspase3、p53相对量表达比较

3 讨 论

由于临床上对肝癌的发病机制尚未研究透彻，所以有越来越多的学者投入到对肝癌的研究之中[9-10]。由于肝癌早期并没有明显的临床症状，导致许多患者不能得到有效的早期治疗，耽误了最佳的治疗时机[11-12]。肝癌发展的过程通常伴随着各种临床症状和危害，其临床症状主要有肝区疼痛、乏力、纳差等，也会经常伴随上消化道出血、肝衰竭、肾衰竭等，当肝癌发展严重时，会造成患者死亡。肝癌患者的生活质量严重下降，对患者家庭和社会造成一定的影响[13-14]。HBx作为乙肝病毒X基因，是HBV基因组的一员，HBx-MALAT-XB130通路的作用在学术界得到了一致的认可，在肝癌的表达中起到了重要的作用[15-16]。

肝癌组织中的细胞生长变化与肝癌的发生和发展具有密切的联系[17-18]。有学者研究表明，对肝癌细胞的生长率进行调控，能够起到抑制肝癌细胞发展的作用。本研究结果显示，阻断HBx-MALAT-XB130通路导致肝癌细胞生长率出现明显上升，说明HBx-MALAT-XB130通路与肝癌细胞的生长关系密切，调控该通路能够影响肝癌细胞生长情况，为肝癌的临床治疗起到一定的参考作用。

肝癌的发生和发展与肝癌细胞的凋亡具有密切联系[19-20]。XB130和HBx的共同表达能够对60Co-γ射线所导致的细胞凋亡情况进行抵抗，并且其共同表达能够对细胞周期起到阻滞作用。本研究结果显示，阻断HBx-MALAT-XB130通路导致肝癌细胞凋亡能力下降，说明HBx-MALAT-XB130通路表达与肝癌细胞凋亡能力具有密切联系，调控该通路能够影响癌细胞凋亡能力，从而干预癌细胞的生长。

大量临床研究资料表明，肝癌的发展与癌细胞的侵袭、迁移能力具有密切联系。对细胞的侵袭和迁移能力进行抑制，能够抑制肝癌细胞的发展。有学者在研究中表明，对胃癌细胞的侵袭和迁移能力进行抑制，能够对胃癌进行调控[21]。本研究对肝癌细胞的侵袭和迁移能力进行了检测，发现阻断HBx-MALAT-XB130通路导致肝癌细胞侵袭、迁移能力上升，说明HBx-MALAT-XB130通路与癌细胞侵袭、迁移密切相关，调控该通路能够影响癌细胞侵袭、迁移能力，从而起到抑制肝癌细胞发展、扩散的作用。

细胞周期作为一个连续不断的过程，是机体细胞活动的基础生物学行为，与细胞增殖和凋亡能力有着密切的联系。细胞分期可分为合成前期、合成期、合成后期3个时期，分别以G1、S、G2来表示。研究表明，在合成前期对癌细胞进行阻滞，能够对其凋亡能力进行调控[22]。本研究对肝癌细胞中细胞周期分布情况进行了检测，发现阻断HBx-MALAT-XB130通路导致肝癌细胞处于G1期的细胞比例出现上升，从而影响细胞凋亡能力，说明HBx-MALAT-XB130通路与肝癌细胞周期分布具有密切联系，调控该通路能够对肝癌细胞周期分布起到阻滞作用。

综上所述，HBx-MALAT-XB130通路与肝癌细胞生长、凋亡、侵袭、迁移及肝癌细胞的细胞周期分布情况有密切的联系，能够为肝癌的临床治疗起到一定的参考作用。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

黄超群：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；刘微：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；高文娟：进行统计学分析；段体龙：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；王丹丹：课题设计，论文撰写